陳湖水,江建坤,易 佳,謝天堯

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275)

安賽蜜(acesulfame-K,簡稱AK糖)是食品中最常見的磺胺類人工合成甜味劑,具有價格低廉和配制方便的特點,因此在食品生產(chǎn)行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[1,2]。近年來,人工合成甜味劑的安全性越來越引起人們的重視,長期過量食用磺胺類人工合成甜味劑超標(biāo)的食品,會對人體的健康造成危害,特別是對代謝排毒能力較弱的老人、孕婦、小孩[3-5]。目前,一些歐盟國家對磺胺類合成甜味劑的使用實行嚴(yán)格的用量限制及在一些特殊的食品中禁止使用磺胺類合成甜味劑。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了各種類型食品中安賽蜜的最大使用量,其中調(diào)味品中的最大使用量為0.50 g/kg[6]。醬油作為一種常見的調(diào)味品,也普遍存在使用安賽蜜的情況。由于醬油具有十分復(fù)雜的基體,微量組分的安賽蜜與大量的無機鹽和有機物共存,直接進樣分析難以滿足測試的要求。因此,建立操作簡單、快速靈敏的分離檢測新方法尚屬于一個具有挑戰(zhàn)性的研究課題。

由于安賽蜜在醬油樣品中的含量較低,在實際樣品測定時存在基體嚴(yán)重干擾問題,需采用對樣品進行凈化、富集和濃縮的前處理方法。常用的樣品前處理技術(shù)包括固相萃取法(SPE)和液液萃取法(LLE)。對于檢測復(fù)雜基體食品樣品中安賽蜜的樣品前處理方法主要采用SPE法,例如,李健和劉寧[7]以中性氧化鋁柱為固相萃取柱,采用HPLC-UV對醬油中糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜3種人工合成甜味劑進行分析檢測;徐琴等[8]以分子印跡聚合物微粒為固相萃取吸附劑,結(jié)合HPLC-二極管陣列檢測器測定了泡菜中的安賽蜜。但對于采用LLE處理醬油樣品中安賽蜜則鮮有文獻報道。針對不同分析方法,SPE和LLE各有其優(yōu)勢或不足。就本文分析方法而言,采用LLE較SPE有明顯優(yōu)勢,避免了SPE處理后需要進一步洗脫的步驟,從而簡化了操作過程,節(jié)約了分析時間。

目前,安賽蜜的檢測方法主要包括分光光度法[9]、離子色譜法[10]、HPLC、HPLC-MS[11-14]和毛細(xì)管電泳法(CE)[15,16]。分光光度法需借助化學(xué)計量學(xué)方法作后續(xù)處理,比較復(fù)雜;離子色譜法存在重疊峰的問題;HPLC是目前應(yīng)用最為廣泛的一種分析方法,但也存在操作復(fù)雜、分析成本高、色譜柱昂貴且容易污染的缺點。CE具有高效、分離速度快、樣品和試劑消耗少的特點,是一種環(huán)境友好型的分析方法。電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(C4D)是新發(fā)展起來的一種CE檢測技術(shù)[17],由于C4D中電極不與溶液接觸,因而具有良好的適用性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。場放大進樣(FASI)是一種簡單高效的毛細(xì)管電泳在線富集方法,富集因子可達數(shù)百以上,可以很好地解決常規(guī)CE在痕量分析中靈敏度不足的問題[18,19]。近年來,國內(nèi)外對于FASI-CE-C4D在食品分析方面的應(yīng)用研究表明,FASI-CE-C4D具有靈敏度高、適用性廣、抗干擾能力強和重現(xiàn)性好的優(yōu)勢,適合現(xiàn)場快速檢測,是食品分析中行之有效的檢測新技術(shù)[20-22]。

本文以醬油中安賽蜜的分離檢測為研究對象,開發(fā)出一種快速高效的液液萃取樣品凈化處理技術(shù),消除醬油樣品中復(fù)雜基體對安賽蜜的測定干擾,結(jié)合FASI-CE-C4D對其進行靈敏檢測。實驗對影響萃取效率和CE分離檢測的關(guān)鍵因素進行了詳細(xì)的探討,包括萃取溶液種類、樣品pH值、萃取體積和時間、CE分離和FASI條件等，為市售醬油樣品中安賽蜜的快速檢測提供了一種靈敏、簡單和低成本的檢測新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

CES2008毛細(xì)管電泳儀(實驗室研制開發(fā))由高壓電源、接觸式/非接觸式雙通道電導(dǎo)檢測器、毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)工作站等部件組成。石英毛細(xì)管柱(45 cm×50 μm,有效長度為40 cm;河北永年光導(dǎo)纖維廠); KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); H1650型電動離心機(湖南湘儀公司); MTN-2800W氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

冰乙酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、鹽酸(廣州化學(xué)試劑廠);安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純,北京國家標(biāo)準(zhǔn)試劑公司)。所用試劑除注明外均為分析純。水為超純水,由Millipore超純水機制備。

用超純水配制質(zhì)量濃度為500 mg/L的安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃冰箱儲存。實驗時,取適量安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用超純水配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

用超純水和冰乙酸直接配制20 mmol/L乙酸溶液作為電泳運行液,現(xiàn)用現(xiàn)配。0.100 mol/L的鹽酸溶液經(jīng)標(biāo)定后使用(精確至0.001 mol/L)。

1.2 樣品前處理

醬油樣品(包括海天、李錦記、中邦、鳳球麥、東古、一滴香等不同品牌和規(guī)格)均采集于中山大學(xué)南校區(qū)超市。

移取1.0 mL市售醬油樣品并準(zhǔn)確稱重(精確至0.000 1 g),置于100 mL容量瓶中,用超純水稀釋定容至刻度。取0.50 mL上述稀釋后的樣品,置于5 mL具塞塑料離心管中,加入0.100 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至1.7左右(通常加入150 μL經(jīng)標(biāo)定的0.100 mol/L HCl即可),搖勻。加入3.0 mL乙酸乙酯,先手動振蕩離心管1 min,再于超聲池中超聲萃取3 min,靜置5 min,然后以5 000 r/min離心5 min,靜置5 min。取上層有機相500 μL至進樣瓶中,于60 ℃氮氣流中吹干。吹干溶劑后的殘留物用適量超純水溶解,隨后進行FASI-CE-C4D測定。

1.3 分析方法

毛細(xì)管在使用前,先將毛細(xì)管的兩端在超聲波清洗器中超聲清洗30 s以消除因端口黏附微粒所引起的毛細(xì)管堵塞,然后按照以下次序分別沖洗毛細(xì)管3 min:超純水→0.1 mol/L NaOH溶液→超純水→0.1 mol/L HNO3溶液→超純水→電泳運行液。實驗中,每2次進樣分析之間僅需用新鮮的運行液沖洗3 min,基線運行時間為5 min。分析過程運行10次后,需更換新鮮的電泳運行液。分離電壓-12 kV,電動進樣-11 kV×8 s。非接觸式電導(dǎo)檢測器輸出的信號通過數(shù)據(jù)工作站采集到微機中進行CE圖譜的記錄和分析。實驗在室溫(25 ℃)、相對濕度≤70%的實驗條件下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 CE分離條件的選擇

選擇合適的電泳運行液體系可以獲得較高的靈敏度和良好的分離度。安賽蜜在水溶液中以陰離子形式存在,因此采用負(fù)高壓分離模式,可以獲得良好的分離效果。但在負(fù)高壓模式中,電滲流的方向與陰離子的電泳方向相反,且電滲流的速度常大于陰離子的電泳速度。因此,電泳運行液中常需加入電滲流抑制劑,如十六烷基溴化銨等。本課題組[15]前期已報道發(fā)現(xiàn),采用20 mmol/L乙酸溶液作為電泳運行液(pH=3.2)時,體系的電滲流極小可以忽略不計,因而不需要添加其他的電滲流抑制劑。同時,該體系具有基線平穩(wěn)、檢測靈敏度高的優(yōu)點。因此,本文采用20 mmol/L乙酸溶液作為電泳運行液,分離電壓為-12 kV。

圖 1 安賽蜜經(jīng)(a)常規(guī)重力進樣(5.0 mg/L)和(b)FASI(0.10 mg/L)的CE-C4D電泳譜圖Fig. 1 CE-C4D electropherograms of acesulfame-K by (a) normal hydrodynamic injection (5.0 mg/L) and (b) FASI (0.10 mg/L) C4D: capacitively coupled contactless conductivity detection; FASI: field-amplified sample injection.

2.2 場放大進樣在線富集條件的選擇

CE在線富集技術(shù)中,場放大進樣富集具有操作簡單、富集效果好的優(yōu)點。FASI通過樣品直接溶于低電導(dǎo)背景值的基質(zhì)溶液中或是超純水中就可以簡單實現(xiàn),這是由于毛細(xì)管管中充滿高電導(dǎo)的背景緩沖溶液,樣品溶解于低電導(dǎo)溶液中,在電動進樣時,毛細(xì)管中的高電導(dǎo)與進樣瓶中的低電導(dǎo)之間的差異使得進樣端口區(qū)間上的電場強度遠大于毛細(xì)管內(nèi)的電場強度,從而使樣品離子在高電場強度下快速進入毛細(xì)管內(nèi)，并在端口界面上達到富集,從而得到電堆積效果,富集因子可達到100以上,進而使檢測靈敏度大幅提高[19]。在場放大進樣富集中,需要優(yōu)化的實驗條件主要有:進樣介質(zhì)的組成、進樣電壓和時間、進樣前的水塞(water plug)。同樣,在前文[15]中已對FASI的條件作了優(yōu)化,本文也采用前文的參數(shù):進樣介質(zhì)為超純水,進樣電壓為-11 kV,進樣時間8 s,重力進樣5 s的水塞。在上述的實驗條件下,測定了人工合成甜味劑安賽蜜的富集因子,結(jié)果表明:通過場放大進樣的在線富集技術(shù),安賽蜜的檢測靈敏度與按常規(guī)進樣方法相比,得到顯著提高(見圖1)。圖1a采用的是常規(guī)的重力進樣,安賽蜜的進樣含量是5.0 mg/L;圖1b采用的是FASI,進樣含量是0.10 mg/L,經(jīng)計算其富集因子為600。應(yīng)指出的是,進樣前的水塞并非為必需步驟,在滿足檢測靈敏度的前提下可以省略,從而簡化實驗步驟。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

對于含人工合成甜味劑安賽蜜的簡單基體食品樣品(如飲料),可以直接用超純水稀釋至合適濃度后,用FASI-CE-C4D分析測定[15]。但是對于具有復(fù)雜基體的醬油樣品,其中含有的大量無機鹽(如NaCl,含量一般為18%),十分不利于FASI對微量安賽蜜的富集,嚴(yán)重時,會使富集效應(yīng)消失。這是因為FASI在負(fù)高壓模式下,樣品中大量無機陰離子(如氯離子)與共存的安賽蜜陰離子在FASI過程中存在著競爭,結(jié)果使得微量組分的安賽蜜進樣量很少,導(dǎo)致安賽蜜的場放大進樣富集效果消失殆盡。因此,在FASI-CE-C4D分析前,對于醬油這種復(fù)雜基體樣品必須進行“凈化”處理,以消除樣品中共存的大量無機鹽的基體干擾,安賽蜜陰離子的進樣量在FASI過程中得到顯著增強,進而獲得很高的檢測靈敏度。樣品凈化處理的內(nèi)容主要由3個步驟組成:首先,將醬油樣品酸化,使以陰離子形式存在于水溶液中的安賽蜜轉(zhuǎn)化為中性分子,以利于轉(zhuǎn)入有機相中;其次,用有機萃取劑對酸化后的樣品進行萃取,使安賽蜜完全轉(zhuǎn)移到有機相中,而無機鹽等則保留在原溶液中,實現(xiàn)復(fù)雜基體的去除;最后,將有機相蒸發(fā)除去,用超純水溶解殘留物后,再進行FASI-CE-C4D測定。

以下將對樣品凈化前處理過程中萃取劑及用量、樣品溶液pH值、萃取方式和萃取時間、樣品蒸干和再溶解等條件進行討論。

2.3.1萃取劑及其用量的選擇

以空白醬油樣品加入2.0 mg/L安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)溶液作為測試樣品,采用不同的有機萃取溶劑,包括環(huán)己烷、乙醚、乙酸乙酯和氯仿,考察其對安賽蜜回收率的影響。結(jié)果表明:環(huán)己烷幾乎不能從水溶液中萃取安賽蜜;采用乙醚和氯仿時回收率低;而乙酸乙酯可以獲得滿意結(jié)果。所以本實驗選乙酸乙酯作為萃取溶劑。

實驗同時考察了乙酸乙酯的用量(1.0～5.0 mL)對回收率的影響。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)乙酸乙酯的用量達到3.0 mL時,安賽蜜的回收率可達到95%以上,進一步加大萃取劑的用量,安賽蜜的回收率趨于穩(wěn)定。因此本實驗乙酸乙酯的萃取量選用3.0 mL。

圖 2 萃取溶劑用量對安賽蜜回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of the amount of extraction solution on the recovery of acesulfame-K (n=5)

2.3.2樣品溶液pH值的選擇

圖 3 醬油樣品酸化后的pH值對安賽蜜回收率的影響(n=5)Fig. 3 Effect of pH values of soy sauce samples after acidification on the recovery of acesulfame-K (n=5)

安賽蜜以鉀鹽的形式穩(wěn)定存在,其pKa值為2.0[15],因此在pH呈中性的水溶液介質(zhì)中,安賽蜜分子將電離成陰離子存在于樣品溶液中。在LLE過程中,存在安賽蜜在水相中的電離平衡,以及安賽蜜在乙酸乙酯有機相與水相之間的分配平衡。在這2個平衡中,分配平衡是主要因素,分配系數(shù)愈大則萃取率逾高。電離平衡是次要因素,但會影響萃取率。為了有效地抑制安賽蜜分子的電離,促使安賽蜜陰離子向中性分子轉(zhuǎn)化,從而有利于安賽蜜進入有機相。因此,十分有必要對原始樣品進行酸化處理。實驗結(jié)果表明,樣品如果未用鹽酸酸化處理,幾乎不能萃取安賽蜜;當(dāng)用鹽酸酸化樣品溶液的pH值至1.7左右時,安賽蜜的萃取回收率可達95%以上(見圖3)。但進一步酸化,pH值<1.3時,回收率開始降低,同時在色譜圖中會出現(xiàn)醬油樣品中其他同存組分的干擾電泳峰。因此,本實驗中樣品溶液經(jīng)鹽酸酸化后的pH值設(shè)為1.7。

2.3.3萃取方法和萃取時間的選擇

實驗分別采用手動振蕩萃取和超聲振蕩萃取兩種方法對樣品進行萃取。結(jié)果表明,手動振蕩萃取與超聲振蕩萃取相結(jié)合,可以取得更好的萃取效果和更穩(wěn)定的回收率結(jié)果。這是因為手動振蕩萃取可以使樣品溶液乳化,這樣在隨后的超聲振蕩萃取中可以取得更好的萃取效果。因此,本實驗采用1 min手動振蕩萃取與3 min超聲振蕩萃取相結(jié)合的萃取方式。

2.3.4靜置時間和離心時間的選擇

超聲振蕩萃取后,為使含有安賽蜜的有機相與原水溶液相良好分層,需進行靜置和離心處理。實驗中考察了靜置時間和離心時間對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明:5 min靜置時間和5 min的離心處理,可有效降低氯離子在測試溶液中的殘留量,故選為實驗所用。

圖 4 醬油樣品經(jīng)凈化處理(a)前、(b)后的FASI-CE-C4D電泳譜圖Fig. 4 FASI-CE-C4D electropherograms of the soy sauce sample (a) before and (b) after clean-up procedure

2.3.5有機試劑的去除和殘留物再溶解

經(jīng)萃取和離心后,移取適量上層有機相溶液轉(zhuǎn)移至干凈的進樣瓶中,在60 ℃的氮氣流中將溶劑揮發(fā)至干,得到殘留物。殘留物用適量的超純水溶解后,進行FASI-CE-C4D進樣測定。

樣品經(jīng)上述凈化處理后,共存的大量無機鹽和有機物基質(zhì)可以得到較好去除,醬油中的安賽蜜獲得了良好的分離檢測。圖4為含安賽蜜的醬油樣品在凈化處理前、后的FASI-CE-C4D電泳譜圖。由圖可知,凈化處理前因大量共存的無機鹽陰離子(即氯離子)與安賽蜜陰離子在FASI過程中存在著競爭進樣,幾乎屏蔽了安賽蜜的進樣,使得微量組分的安賽蜜進樣量很少,結(jié)果檢測不到安賽蜜的電泳峰。在樣品凈化處理后,圖4a中極大的Cl-峰在圖4b中顯著降低,干擾物質(zhì)得到有效去除,少量殘留的Cl-已不再干擾安賽蜜的FASI富集效果,安賽蜜得以靈敏檢出。

2.4 醬油中其他共存組分的干擾情況

市售醬油中通常會含有一定量的其他食品添加劑,如防腐劑以及風(fēng)味劑等。因此,實驗中著重考察了食品中常見的防腐劑(苯甲酸、山梨酸)、風(fēng)味劑(檸檬酸、蘋果酸)對測定結(jié)果的影響。結(jié)果未檢測到苯甲酸、山梨酸的電泳峰,不干擾實驗結(jié)果,這是因為苯甲酸、山梨酸具有與電泳運行液乙酸較接近的電離常數(shù)值而不能遷移至檢測器端,因此未能檢出。檸檬酸、蘋果酸的干擾在樣品凈化處理過程中已完全除去,不干擾安賽蜜的測定。

醬油樣品相對復(fù)雜,即使經(jīng)LLE處理后,也可能是多種物質(zhì)共存。由于以下3方面的原因,使得FASI-CE-C4D色譜圖并不復(fù)雜。①醬油樣品中部分組分在LLE處理過程中,保留在水相中而得以除去,未能進入有機相。②在負(fù)高壓分離模式下,只有陰離子組分才能遷移至檢測器中被檢出,而陽離子組分則不能被檢出。③由于采用的是乙酸電泳運行液,對于那些小于乙酸電離常數(shù)值的陰離子,不能遷移至檢測器,也不能被檢出。那些稍大于乙酸電離常數(shù)值的陰離子,電泳峰的出峰時間較長(10 min以上)而落在檢測窗口之外。因此其他與安賽蜜一起萃取轉(zhuǎn)移到測試溶液中的少量其他組分并不會全部顯現(xiàn)在電泳分離圖中。

2.5 方法學(xué)評價

用空白醬油樣品作為基體,配制安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.50～150 mg/kg)。對安賽蜜含量(x, mg/kg)與其峰面積(y)進行線性回歸,方程為y=361.51x+26.68,線性相關(guān)系數(shù)為0.998 1。

在上述選定的實驗條件下,對空白加標(biāo)醬油樣品作適當(dāng)稀釋后進行樣品前處理和FASI-CE-C4D測定。醬油中安賽蜜的理論含量(x′, mg/kg)與實際測出含量(x, mg/kg)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系:x=1.012 1x′-0.057 5,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 1。上述線性方程的斜率和線性相關(guān)系數(shù)接近1,表明方法具有良好的測定準(zhǔn)確度。

以目標(biāo)物的峰高與背景噪聲的3倍和10倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限和定量限,得出醬油樣品中安賽蜜的檢出限和定量限分別為0.15 mg/kg和0.48 mg/kg。為了進一步消除待測樣品中殘余的基體干擾,可以采用標(biāo)準(zhǔn)加入法或其他定量方法[18]。本文實驗采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。

為了考察方法的精密度,進行了日內(nèi)(intra-day)和日間(inter-day)精密度測定。對含2.0 mg/kg安賽蜜的醬油樣品在同一日和不同日平行測定5次,結(jié)果表明,日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.1%和6.6%。表明該方法具有較高的靈敏度和較好的重復(fù)性,可以滿足醬油中安賽蜜的定量分析要求。

圖 5 空白醬油樣品和加標(biāo)醬油樣品凈化處理后的FASI-CE-C4D電泳譜圖Fig. 5 FASI-CE-C4D electropherograms of acesulfame-K in the blank and spiked soy sauce samples a. blank sample; b. spiked with 0.80 mg/kg acesulfame-K; c. spiked with 2.0 mg/kg acesulfame-K.

2.6 實際樣品測定

為進一步評價本文方法的實際應(yīng)用價值,將建立的方法用于6個不同品牌和規(guī)格醬油樣品中安賽蜜含量的測定(見表1)。結(jié)果表明,6個醬油樣品有3個檢測出安賽蜜,含量分別為230、161和189 mg/kg(均在國家標(biāo)準(zhǔn)允許的范圍內(nèi)); 3個醬油樣品未檢出安賽蜜,與產(chǎn)品的瓶簽標(biāo)注一致。空白醬油樣品和加標(biāo)醬油樣品經(jīng)過樣品凈化預(yù)處理后的FASI-CE-C4D電泳譜圖見圖5。對實際樣品進行加標(biāo)回收試驗,加標(biāo)水平為2.0 mg/kg,加標(biāo)回收率為92.3%～108.1%。每個水平進行5次平行試驗,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8.0%。

表 1 6個醬油樣品中安賽蜜含量及加標(biāo)回收率(n=5)

a): the original soy sauce samples diluted 100 times. ND: not detected.

3 結(jié)論

采用場放大進樣富集技術(shù)-毛細(xì)管電泳非接觸式電導(dǎo)檢測法,結(jié)合液液萃取樣品凈化處理技術(shù),對醬油樣品中人工合成甜味劑安賽蜜進行了分離檢測。本文方法具有操作過程簡單、靈敏度高、分析時間短、試劑消耗少的優(yōu)點,是一種經(jīng)濟實用、環(huán)境友好的醬油中安賽蜜的分析方法,為復(fù)雜基體食品中安賽蜜的快速分析檢測提供了新途徑。