李 棟,張 芹,張圣虎,徐 誠,陳建秋,劉艷華,宋寧慧*,郭瑞昕*

(1. 中國藥科大學(xué)工學(xué)院, 江蘇 南京 211198; 2. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所, 江蘇 南京 210042)

有機(jī)磷酸酯(OPEs)作為多溴聯(lián)苯醚類溴代阻燃劑主要替代品,近年來被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[1],由于主要以物理摻雜方式添加入產(chǎn)品,極易釋放到各環(huán)境介質(zhì)中,其在自然環(huán)境中的暴露達(dá)μg/L、μg/kg級別[2-5]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,OPEs具有神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌干擾、致畸性和潛在致癌性等多種毒性危害[6-8],對人體健康造成潛在威脅。

研究發(fā)現(xiàn),OPEs可通過呼吸、皮膚接觸、攝入等途徑進(jìn)入人體[5],被吸收后會脫去側(cè)鏈,主要代謝為以磷酸二苯酯等為代表的磷酸二酯化合物,后通過尿液等途徑排出體外[9-11]。同時(shí),當(dāng)人體暴露于外源性環(huán)境污染時(shí),機(jī)體會產(chǎn)生大量活性氧并誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)DNA氧化應(yīng)激,從而造成DNA損傷[12],而8-羥基-2′-脫氧鳥苷(8-OHdG)是DNA氧化損傷的產(chǎn)物,可作為代謝終產(chǎn)物隨尿液排出體外[13,14],被廣泛用于評估環(huán)境污染物引起的人體氧化性DNA損傷程度[15,16]。因此,同時(shí)檢測人體尿液中OPEs代謝物和8-OHdG,可以更好地評估人體內(nèi)OPEs暴露水平及其對人體造成的危害。

目前尚未有研究報(bào)道同時(shí)測定尿液中OPEs代謝物和8-OHdG的方法。單獨(dú)檢測這兩類物質(zhì)的方法,主要以氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)為主,但由于使用GC-MS/MS方法時(shí)需要將目標(biāo)物進(jìn)行衍生化預(yù)處理,過程復(fù)雜,不利于大批量尿液樣本檢測[17-19],而LC-MS/MS因其高選擇性和高靈敏度被廣泛應(yīng)用。李佩等[20]利用固相萃取柱-液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),測定人尿液中的有機(jī)磷酸二酯,檢出限為0.005～0.2 μg/L; Kosarac等[21]建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,測定尿中有機(jī)磷系阻燃劑代謝物,檢出限為0.08～0.25 ng/mL;王麗英等[14]采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析人尿液中8-OHdG的含量,定量限為0.02 ng/mL; Kataoka等[22]建立了全自動在線管內(nèi)固相微萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定尿液中8-OHdG,檢出限為8.3 ng/L。然而單獨(dú)分析兩類物質(zhì)成本高、耗時(shí)長,且由于待測目標(biāo)物極性差異較大,以及尿液樣品基質(zhì)復(fù)雜,采用單純的商品化固相萃取柱易導(dǎo)致回收率偏低[21,23,24]。

因此,本實(shí)驗(yàn)基于對中國環(huán)境介質(zhì)中OPEs污染特征的研究結(jié)果,選取檢出率較高、濃度較大、較為常見且應(yīng)用廣泛的7種OPEs代謝物,采用自制混合型小柱結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),建立了同時(shí)測定其磷酸二酯代謝物和生物標(biāo)志物8-OHdG的方法,并將該方法應(yīng)用于人體尿液實(shí)際樣品的檢測,評價(jià)了人體內(nèi)OPEs暴露水平與氧化損傷的產(chǎn)物8-OHdG之間的關(guān)系。該方法為揭示OPEs在體內(nèi)的代謝方式和暴露量、科學(xué)評價(jià)OPEs暴露水平與其代謝物以及氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG之間的關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity,美國MS-ABSCIEX QTRAP 4500);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-300,瑞士Buchi公司);恒溫氮吹儀(N-EVAP,天津奧特賽斯公司);高速離心機(jī)(Centrifuge 5430R,德國Eppendorf公司);數(shù)顯恒溫水浴箱(HH-4,常州國華電器有限公司);數(shù)顯往復(fù)振動搖床(HS510,德國IKA公司);微型漩渦混合儀(WH-3,上海滬西分析儀器廠);電子天平(AG-285,瑞士Mettle公司);超純水儀(Milli-Q,美國Millipore公司)。

鹽酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);氨水(色譜純,國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有公司);氯化鈉(純度>99%)和無水硫酸鈉(純度>99%)(美國Sigma-Aldrich公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18和石墨化炭黑(graphitized carbon black, GCB)(美國Agilent公司)。

7種OPEs代謝物(磷酸二乙酯(diethyl phosphate, DEP)、磷酸二正丁酯(di-n-butylphosphate, DnBP)、磷酸二苯酯(diphenyl phosphate, DPhP)、雙(2-氯乙基)磷酸酯(bis(2-chloroethyl) phosphate, BCEP)、雙(1-氯-2-丙基)磷酸酯(bis(1-chloro-2-propyl) phosphate, BCPP)、雙(丁氧乙基)磷酸酯(bis(butoxyethyl) phosphate, BBOEP)、雙(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯(bis(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate, BDCPP))及8-OHdG標(biāo)準(zhǔn)品均購于百靈威科技有限公司,純度大于95%,結(jié)構(gòu)式見圖1。

上述8種標(biāo)準(zhǔn)品均用乙腈配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,并配制1 mg/L的8種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃儲存。

圖 1 7種OPEs代謝物和8-OHdG的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of seven metabolites of organophosphate esters (OPEs) and 8-OHdG

1.2 樣品前處理

取冰凍(-80 ℃)冷藏尿樣,于室溫下緩慢解凍,渦旋5 min后取10 mL,置于50 mL離心管中,加入4 mL 6 mol/L HCl振蕩,80 ℃水浴2 h酸解,冷卻至室溫;依次加入10 mL乙腈溶液、3 g NaCl,渦旋振蕩1 min后離心(8 000 r/min)5 min;取上層5 mL乙腈,轉(zhuǎn)移至自制小柱(小柱由100 mg PSA、20 mg GCB、10 mg C18、4 g無水Na2SO4填充);再用5 mL乙腈淋洗兩次,收集的洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,N2吹干后,用乙腈定容至1 mL,待HPLC-MS/MS測定。

1.3 儀器分析

色譜條件:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm,美國Agilent公司);柱溫:30 ℃;流動相:0.2%(v/v)氨水溶液(A)和乙腈(B);流速:0.3 mL/min;流動相梯度洗脫為0～2 min, 99%A; 2～4 min, 99%A～80%A; 4～5 min, 80%A～60%A; 5～7 min, 60%A～45%A; 7～9 min, 45%A～60%A; 9～9.1 min, 60%A～99%A; 9.1～10 min, 99%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式;多反應(yīng)離子監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM);離子源溫度:500 ℃,離子噴霧電壓:4 500 V;氣簾氣(curtain gas, CUR)壓力為35.0 kPa;噴霧氣(ion source gas 1, GS1)壓力為55.0 kPa;輔助加熱氣(ion source gas 2, GS2)壓力為60.0 kPa,其他參數(shù)經(jīng)優(yōu)化后見表1。

1.4 質(zhì)量控制與保證

目標(biāo)化合物根據(jù)保留時(shí)間和特征離子定性,檢測化合物與標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間控制在±2%以內(nèi),所對應(yīng)的選擇離子對的峰面積比例控制在±20%以內(nèi)進(jìn)行定性確認(rèn),并采用最高豐度或背景干擾最少的選擇離子進(jìn)行定量分析。每一組樣品(10～15個)中添加1個基質(zhì)空白、1個樣品重復(fù)和1個基質(zhì)加標(biāo)回收進(jìn)行質(zhì)量控制。方法空白樣品中目標(biāo)化合物含量均低于檢出限。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)7種OPEs代謝物及8-OHdG的分子結(jié)構(gòu),選擇ESI源負(fù)離子模式掃描。采用半自動進(jìn)樣方式,將100 μg/L的8種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別注入離子源,流速為5 μL/min,分別在ESI+模式和ESI-模式下進(jìn)行全掃描,結(jié)果表明負(fù)模式比正模式響應(yīng)高。分別進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,確定[M-H]-峰,然后以分子離子作為母離子,依次進(jìn)行單離子掃描和子離子掃描,得到目標(biāo)化合物的定性、定量離子對,并在MRM模式下對目標(biāo)化合物各質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最終質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 8種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)

* Quantitative ion.

圖 2 8種目標(biāo)物(100 μg/L)的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram of the eight target compounds (100 μg/L)

圖 3 不同固相萃取小柱對回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of different solid phase extraction cartridges on the recoveries (n=3)

通常,堿性條件可以提高化合物[M-H]-的離子響應(yīng)[9,25],本實(shí)驗(yàn)采用ESI-模式,分別以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.2%(v/v)氨水溶液和乙腈-0.2%(v/v)氨水溶液作為流動相,考察8種目標(biāo)物(100 μg/L)的色譜分離效果。結(jié)果表明,乙腈比甲醇更容易洗脫目標(biāo)物,大大縮短了化合物在色譜柱中的保留時(shí)間;0.2%(v/v)氨水溶液相比水溶液可明顯提高負(fù)離子,尤其是8-OHdG的響應(yīng)值。因此,選擇乙腈-0.2%(v/v)氨水溶液為流動相,圖2為該流動相下8種目標(biāo)物(100 μg/L)的總離子流色譜圖。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1固相萃取柱的選擇

由于8種目標(biāo)物的極性差異較大,而尿液基質(zhì)復(fù)雜,會干擾目標(biāo)分析物的檢測[20,23],因此對樣品進(jìn)行凈化至關(guān)重要。本研究用乙腈作為萃取溶劑[24],設(shè)計(jì)了液液萃取結(jié)合自制混合小柱的方式,濃縮提取尿液中的目標(biāo)分析物。自制小柱由PSA、GCB、C18和無水Na2SO4填充,分別考察了該柱與商品化小柱Oasis HLB的萃取效果,各設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明Oasis HLB小柱對水溶性較大的DEP、BDCPP和BCEP的回收率較低,分別為20%、53%和55%,而自制小柱的萃取回收率在60%～98%之間,能滿足痕量分析的要求(見圖3)。

2.2.2pH的選擇

尿液中,部分代謝產(chǎn)物結(jié)合態(tài)所占比例較高,根據(jù)文獻(xiàn)[26],可以使用酸解鹽酸化解除軛合態(tài)。而正常尿液pH值為5～8,在此狀態(tài)下磷酸二酯化合物呈現(xiàn)負(fù)離子模式,因此適當(dāng)調(diào)節(jié)溶液pH為酸性有助于提高萃取尿液中磷酸二酯化合物的回收率[20,23]。故本研究比較了不同pH值對目標(biāo)物回收率的影響,各設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。如圖4所示,當(dāng)pH分別為4.5、5.0和5.5時(shí),目標(biāo)物的回收率為23%～95%。pH=5時(shí)各目標(biāo)化合物有較好的回收率,因此最終確定pH為5。

表 2 8種目標(biāo)物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、日間和日內(nèi)RSD、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

圖 4 尿液不同pH值對回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of different pH values of urine on the recoveries (n=3)

2.2.3GCB用量的選擇

GCB對色素、固醇、平面結(jié)構(gòu)的基質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附凈化作用[27]。根據(jù)本課題組之前的研究[26],先固定PSA的用量為100 mg,考察GCB添加量對目標(biāo)物回收率的影響,各設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。由圖5可知,當(dāng)GCB添加量分別為10、15、20和25 mg時(shí),目標(biāo)物回收率為23%～95%;隨著GCB用量增加,回收率開始增加,但當(dāng)GCB的用量為25 mg時(shí)，回收率開始降低;僅當(dāng)GCB的用量為20 mg時(shí)，各目標(biāo)物的回收率為63%～95%，基本符合檢測要求，因此最終確定GCB的用量為20 mg。

圖 5 GCB的量對回收率的影響(n=3)Fig. 5 Effect of GCB amount on the recoveries (n=3)

2.2.4C18用量的選擇

C18鍵合硅膠由于具有豐富的硅羥基,能形成穩(wěn)定的Si-O-Si型的化學(xué)鍵,避免固定相流失,另一方面可結(jié)合不同的官能團(tuán),去除一些油脂等非極性雜質(zhì),但萃取極性化合物時(shí),C18反相填料存在滲透吸附容量低、回收率低等問題[28]。本實(shí)驗(yàn)中,固定PSA(100 mg)、GCB(20 mg),考察C18用量對回收率的影響。在自制小柱中分別加入5、10、15和20 mg C18,結(jié)果顯示,隨著C18用量的增加,回收率增加,當(dāng)C18超過10 mg時(shí),回收率基本上不再增加,因此最終確定自制萃取小柱C18的用量為10 mg。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法準(zhǔn)確度與精密度

本研究采用外標(biāo)法定量,分別配制0.1、1、5、10、20、50、100和200 μg/L的8種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以特征離子響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)(y),目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示,目標(biāo)物在0.1～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2為0.997～0.999。以信噪比S/N=3計(jì)算檢出限(LOD),S/N=10計(jì)算定量限(LOQ),結(jié)果表明,7種OPEs代謝物的檢出限為0.03～18.33 ng/L, 8-OHdG檢出限為13.03 ng/L。同時(shí)對10 μg/L標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液連續(xù)測定3 d,每天測定3次,計(jì)算出日間和日內(nèi)精密度,結(jié)果見表2。

2.3.2方法的回收率

在空白尿液(目標(biāo)物含量低于檢出限)中分別添加5、50、100 μg/L 3個水平的目標(biāo)物,設(shè)置5個平行樣,按照1.2節(jié)所述方法對樣品進(jìn)行前處理,考察方法的精密度與回收率。結(jié)果見表3和圖6,除DEP外,其他OPEs代謝物的平均加標(biāo)回收率為72.91%～114.56%, 8-OHdG的平均加標(biāo)回收率為88.63%～97.72%, RSD為1.9%～9.4%,這可能與DEP有較強(qiáng)的極性與水溶性有關(guān)[20]。

2.3.3方法學(xué)比較

如表4所示，將本方法與已報(bào)道的單獨(dú)測定OPEs代謝物和8-OHdG的方法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示,本方法檢出限較低,檢測時(shí)間較短,有較高的回收率,靈敏且高效,滿足定量分析的檢測要求。

表 3 加標(biāo)尿樣中7種OPEs代謝產(chǎn)物及8-OHdG的回收率和RSD(n=5)

圖 6 (a)空白尿樣和(b)加標(biāo)尿樣的總離子流圖Fig. 6 Total ion chromatogram of (a) blank urine sample and (b) spiked urine sample

2.4 實(shí)際樣品分析

從南京市金山醫(yī)院體檢中心隨機(jī)收集15組成人(20～50歲)晨尿,實(shí)際尿樣的檢測色譜圖見圖7。使用上述方法測定尿液中7種OPEs代謝物和8-OHdG的含量,如表5所示,除DEP(40%)與BBOEP(13%)之外,其他化合物的檢出率均達(dá)100%, 7種OPEs代謝物的總和質(zhì)量濃度范圍為6.24～46.07 μg/L,含量稍低于比利時(shí)人尿中OPEs代謝物檢測值(9.27～54.2 μg/L)[9],但高于廣州(0.5～6.7 μg/L)[20];其中質(zhì)量濃度最高的單體是BBOEP,平均為5.01 μg/L,其次是DnBP(3.81 μg/L),最低的是BCEP,質(zhì)量濃度范圍是0.48～0.53 μg/L,平均質(zhì)量濃度是0.52 μg/L。在加拿大當(dāng)?shù)刂驹刚叩哪蛞褐?BBOEP幾乎檢測不到,BCEP質(zhì)量濃度最高(ND～12.33 μg/L), DnBP質(zhì)量濃度最低,最大質(zhì)量濃度為0.28 μg/L[29]。而孕婦尿液中,DPhP是最豐富的OPEs代謝物,質(zhì)量濃度為0.13～25.2 μg/L[21]。在另一項(xiàng)類似的研究[25]中,也發(fā)現(xiàn)了較高水平的DPhP(37.0 μg/L)。

表 5 實(shí)際尿樣中7種OPEs代謝物和8-OHdG的質(zhì)量濃度

* Significant atp<0.05 level; ** significant atp<0.01 level.

圖 7 實(shí)際尿樣的總離子流圖Fig. 7 Total ion chromatogram of real urine sample

如表6所示，7種OPEs代謝物和8-OHdG的相關(guān)性分析結(jié)果表明:DnBP、BCEP、BCPP、BDCPP、7種OPEs代謝物總量和8-OHdG兩兩之間顯著相關(guān),說明已暴露的OPEs濃度水平可能導(dǎo)致DNA損傷,從而影響人體氧化損傷產(chǎn)物8-OHdG的產(chǎn)生,OPEs體內(nèi)暴露水平和氧化損傷的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文建立了自制混合型小柱-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測人體尿液中7種OPEs代謝物及DNA損傷生物標(biāo)志物8-OHdG的分析方法。該方法操作簡單,靈敏高效,適用于人體尿液中OPEs代謝產(chǎn)物及8-OHdG同時(shí)定性、定量檢測,為更全面評價(jià)OPEs暴露水平及機(jī)體損傷等提供了研究基礎(chǔ)。