陳澤冠

摘 要：目的：建立血液中阿米替林的高效液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）檢測方法。方法：以乙腈為沉淀劑，經蛋白質沉淀，取上清液進高效液相串聯質譜系統(tǒng)（LC-MS/MS）分析。結論：阿米替林的標準曲線方程為Y=-0.00996052+2.83477*X（R^2=0.9998），定量下線為10ng/mL（S/N≥10：1），線性范圍為10～300ng/mL。阿米替林的精密度（RSD）在0.60～1.64%之間，準確度為99.08～122.84%，在低、中、高質量濃度下，阿米替林的平均提取回收率為97.99～98.22%。該方法操作簡單，靈敏度高，特異性強，可用于血液中阿米替林的定量測定。

關鍵詞：阿米替林;血液;高效液相色譜串聯質譜法

中圖分類號：R115 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2020）01-0247-02

阿米替林（amitripthyline）是臨床最常用的三環(huán)類抗抑郁藥，能選擇性地抑制中樞神經突觸部位對去甲腎上腺素（NA）和5-羥色胺（5-HT）的再攝取，使突觸NA和5-HT的含量增加并促進突觸后膜5-HT2受體的敏感性。阿米替林經肝臟代謝，主要代謝產物為去甲替林，也有阿米替林的N-氧化物和10-羥衍生物以及去甲替林的10-羥衍生物，均有活性。

目前，國內外文獻報道的有關阿米替林血濃度的測定方法較多，包括高效液相色譜法（HPLC）[1]、氣相色譜/質譜聯用色譜法（GC-MS）[2]、高效液相色譜/串聯質譜聯用法（LC-MS，LC-MS/MS）[3-5]。本文采用高效液相色譜串聯質譜法（LC-MS/MS），采用蛋白沉淀方法測定血液中阿米替林濃度。

1 材料與試藥

1.1 儀器

臺式三重四極桿串接質譜系統(tǒng)（含ESI電噴霧離子源）;U3000二元超高效LC;德國賽多利斯Quintix35-1CN。

1.2 試劑

鹽酸阿米替林，批號：100518-201303，純度：99.7%，中國食品藥品檢定研究院;SKF525A，批號：3-SNM-27-2，純度：99.83%，Toronto。

1.3 色譜條件

分析柱為Allure PFP Propyl 100mm×2.1mm×5μm，流動相為乙腈：20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液（70∶30），流速為200μL/min。柱溫為常溫。

1.4 質譜條件

電噴霧離子源（H-ESI）正離子選擇多反應檢測（SRM）掃描分析，定量分析離子對分別為：m/z278.300→m/z233.268（阿米替林）;m/z354.300→m/z209.000（SKF525A）。

2 標準溶液的制備

在空白血液中分別加入阿米替林的工作液，配置成阿米替林濃度分別為10、20、50、100、200、300ng/mL的血液標準液。

3 血液樣品處理

精密量取100μL血液，加入內標50μL和沉淀劑乙腈900μL，混旋2min，10000轉/min離心2.5分鐘，取上清液1μL供LC-MS/MS分析。

4 方法考察

4.1 專屬性

分別取6份不同來源的不服用阿米替林的正常人空白血液100μL，不加內標，按“血液樣品處理”項處理，進樣分析，得空白樣品色譜圖。另取空白血3份，1份加內標，1份加分析物，1份加內標和分析物，同法處理，得相應色譜圖。

4.2 標準曲線與定量下線

含藥標準曲線血液按“血液樣品處理”處理后進樣分析。以阿米替林添加濃度為X軸，樣品與內標物的峰面積比為Y軸，進行線性回歸，經“Equal”權重得阿米替林標準曲線圖。

4.3 精密度、準確度和提取回收率

取24份空白血液，分別配制定量下線及低、中、高質量濃度質控樣品各6份，按“血液樣品處理”項處理，進樣分析，連續(xù)測定3批，計算精密度和準確度。

分別配制低、中、高質量濃度的質控樣品各8份，其中6份于提取前加入工作液和內標，另2份于提取后加入工作液和內標，進樣分析，計算提取回收率。

4.4 穩(wěn)定性

制備低、高質量濃度的血液質控樣品，分別考察在常溫光照放置放置24h、反復凍融3次、-70℃凍存1個月、進樣器內24h條件下的穩(wěn)定性。

4.5 基質效應

分別取6種不同來源的空白血清90μL，按“血液樣品處理”處理，得空白基質后，分別加入低、高質量濃度工作液10μL及內標50μL，制備成基質考察樣品，進樣分析，得分析物與內標峰面積比值A1。用去離子水代替血液，同法操作，得分析物與內標峰面積比值A2。內標歸一化的基質因子=A1/A2×100%。

5 結果

5.1 專屬性

阿米替林的保留時間約為4.54min，SKF525A的保留時間約為5.70min，血液中內源性物質對目標分析物及其對應內標的測定無干擾，專屬性好，見圖1。

5.2 標準曲線與定量下限

阿米替林的標準曲線方程為Y=-0.00996052+2.83477* X（R^2=0.9998），定量下線為10ng/mL（S/N≥10∶1），線性范圍為10～300ng/mL。

5.3 精密度、準確度和提取回收率

阿米替林的精密度（RSD）在 0.60～1.64%之間，準確度為99.08～122.84%，在低、中、高質量濃度下，阿米替林的平均提取回收率為97.99～98.22%，結果見表1。

5.4 穩(wěn)定性

含藥血液質控樣品在常溫光照下放置24h、反復凍融3次、-70℃凍存1個月、進樣器內24h各條件下穩(wěn)定，RSD小于15%。

5.5 基質效應

阿米替林在低和高2個質量濃度水平下的內標歸一化基質因子RSD分別為1.87%、0.85%，小于15%，樣品測定不受基質效應影響。

6 討論

本實驗采用LC-MS/MS建立的檢測人血液中阿米替林的方法，所需血液樣品量少，專屬性好，靈敏度高，準確穩(wěn)定。以乙腈為沉淀劑，采用蛋白沉淀法處理樣品，簡單快捷，可快速對樣品進行定性定量分析。

參考文獻

[1] 李金恒，許勁秋，曹曉梅，等.反相高效液相色譜法測定血漿中阿米替林及其代謝物去甲替林的總濃度和游離濃度[J].中國藥理學通報，2001，17（1）：104.

[2] Paterson S，Cordero R，Burlinson S.Screening and semi-quantitative analysis of post mortem blood for basic drugs using gas chromatography/ion trap mass spectrometry[J].J Chromatogr B，2004，813（1）：325.

[3] Castro A，Concheiro，M，Quintela O.LC-MS/MS method for the determination of nine antidepressants and some of their main metabolites in oral fluid and plasma-Study of correlation between venlafaxine concentrations in both matrices[J].J Pharm Biomed，2008，48（1）：184.

[4] Shinozuka T，Terada M，Tanaka E.Solid-phase extraction and analysis of 20 antidepressant drugs in human plasma by LC/MS with SSI method[J].Forensic Sci Int，2006，162（1）：108.

[5] 王賢親，吳健章，李艷霞，等.LC-MS/MS測定人血漿中阿米替林的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（11）：1846-1849.