鬧 敏，王月洪，烏日嘎，贊 根，蘇麗婭

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院 呼和浩特 010110）

ALF 是一種起病急、進(jìn)展迅速、預(yù)后兇險(xiǎn)的疾病和綜合征[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不完全明確，有學(xué)者[2]提出肝衰竭發(fā)生發(fā)展過程中，除了大量肝細(xì)胞死亡還存在2種典型重要改變：炎癥細(xì)胞浸潤與微循環(huán)障礙；分別反映肝衰竭時(shí)出現(xiàn)的免疫損傷與缺血缺氧及再灌注損傷，肝組織依次經(jīng)受這三重致死性打擊是ALF 走向不可逆轉(zhuǎn)結(jié)局的主要推動(dòng)機(jī)制。面對(duì)ALF治療陷入瓶頸期的情況[3-5]，阻斷疾病發(fā)展的主要推動(dòng)機(jī)制，掃除有效防治策略建立上的障礙迫在眉睫。蒙藥給旺-9味為蒙醫(yī)治療肝損傷的經(jīng)典方，廣泛用于肝熱、肝血熾盛熱、肝硬化、脂肪肝、急性肝損傷、病毒性肝炎、酒精性肝損傷等疾病療效顯著[6]。有研究表明給旺-9 具有保肝作用以及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗脂質(zhì)過氧化的作用[7-11]。另外本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蒙藥給旺-9可明顯減輕D-GalN 誘導(dǎo)ALF 模型大鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶水平，明顯減輕肝細(xì)胞壞死程度，減輕炎性細(xì)胞浸潤等。基于給旺-9 味在治療肝膽疾病方面具有優(yōu)勢(shì)和前景且在阻斷ALF 發(fā)展的主要推動(dòng)機(jī)制中有一定的作用，本研究通過觀察給旺-9對(duì)ALF 模型大鼠肝臟細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ等指標(biāo)的影響以及對(duì)形態(tài)學(xué)的影響從免疫調(diào)控作用角度探討蒙藥給旺-9 保肝作用，為該藥防治ALF 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其后續(xù)保肝作用機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為揭示肝衰竭的發(fā)病機(jī)制提供新的思維方式并使其更好地應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性SD 大鼠（北京市斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002）；大鼠被飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，大鼠詞料由該實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：清潔級(jí)動(dòng)物詞養(yǎng)室，室溫15-20℃，濕度（60-80）%，定時(shí)通風(fēng)換氣，自然明暗周期。

1.2 藥品

D-GalN（美國sigma 公司，準(zhǔn)字號(hào)：G500）；給旺-9味（庫倫制藥廠，國家準(zhǔn)字號(hào)：Z15020878）；復(fù)方甘草酸苷，商品名：美能（中國材藥業(yè)有限公司準(zhǔn)字號(hào)：17259）；伊紅染液（成都成科匯博科技有限公司，批號(hào)：G1040）；蘇木素染液（成都成科匯博科技有限公司，G1140）；中性樹膠（北京索萊寶有限公司，G8590）；Leica石蠟（德國Leica公司，批號(hào)39601006）。

1.3 主要試劑

氫氧化鈉（天津永晟精細(xì)化工有限公司，準(zhǔn)字號(hào)：0140101）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，準(zhǔn)字號(hào)：F20100407）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，準(zhǔn)字號(hào)：20171211）；AST、ALT 試劑盒、IL-2，6 試劑盒、TNF-α試劑盒、IFN-γ試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，準(zhǔn)字號(hào)：201907）。

1.4 主要儀器

TOSHIBA 全自動(dòng)生化分析儀，型號(hào)：Accute TBA-40FR；酶標(biāo)儀：北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)：DNM-960；離心機(jī)：微量高速離心機(jī)（國產(chǎn)）型號(hào)：TG16W；LeicaRM2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；LeicaHI1210 攤片機(jī)；LeicaHI220 烘片機(jī)；LeicaDFC450 顯微鏡；YD-12G 生物組織脫水機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

將72 只清潔級(jí)雄性SD 大鼠隨機(jī)分為六組：空白組、模型組、陽性組、蒙藥給旺-9 味低中高劑量三組，各12 只，給予普通飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天，次日開始給藥，所有藥物均以0.5% CMC-Na 為溶媒，換算等效臨床劑量后，陽性藥美能組0.45 g·kg-1·天-1，蒙藥給旺-9味低、中、高劑量組分別（0.4 g、0.8 g、1.6 g）·kg-1·天-1劑量灌胃，空白組與模型組給予等容量0.5%CMC-Na 以作對(duì)照。灌胃體積20 mL·kg-1，每日一次，連續(xù)10天。

2.2 動(dòng)物模型的建立

末次給藥后禁食12 h，除空白組外，其余各組大鼠單次腹腔注射600 mg·kg-1D-GalN（D-GalN 溶于無菌生理鹽水中，用1 mmol·L-1的NaOH 將pH 調(diào)至7.0，配置成濃度為10% 的溶液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定600 mg·kg-1為最佳造模）進(jìn)行造模。造模2 h 后立即給予相應(yīng)藥物灌胃，間隔12 h 后再灌胃1 次，方法同上。

2.3 標(biāo)本釆集與處理

動(dòng)物處死前24 h，禁食不禁水。D-GalN 造模后48 h，腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈采血，促凝管接血，3000 rpm 速度離心15 min，取上清液，存放于-20℃冰箱待檢。處死動(dòng)物分離出肝組織，裝于DEPC水處理過的EP 管中，放置液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存待測。取肝右葉固定部位染色、顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4 觀察指標(biāo)

大鼠血清肝功能指標(biāo)檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀嚴(yán)格按照試劑說明測定血清ALT、AST；肝組織免疫指標(biāo)檢測：肝勻漿取上清液采用Ellisa 法檢測IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ；組織病理形態(tài)學(xué)學(xué)觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析，計(jì)量資料±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠血清中的AST、ALT水平

與空白組比較，模型組大鼠血清AST、ALT水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.05），模型成立；與模型組比較，陽性組、蒙藥低、中劑量組均顯著降低ALT水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）（表1）。

4.2 各組大鼠肝臟中的IL-2、IL-6、TNF-a、IFN-γ 水平（表2）

4.2.1 IL-2

與空白組比較模型組IL-2水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）、蒙藥低、中劑量組IL-2水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低IL-2 水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組IL-2水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（+P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中的AST、ALT（±s，n = 12）

表1 各組大鼠血清中的AST、ALT（±s，n = 12）

注：#P ＜0.05 vs blank group；*P ＜0.05 vs model group

組別空白組模型組陽性組低劑量組中劑量組高劑量組AST/（pg·mL-1）119.73±13.111145.20±630.16#109.46±513.82#4358.32±3947.695442.888±3211.8#5527.03±3506.12 ALT/（pg·mL-1）31.64±3.841091.81±209.15#631.91±293.79#*500.96±305.28#*208.31±160.78*644.225±389.69#

4.2.2 IL-6

與空白組比較模型組IL-6水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）、蒙藥低、中劑量組IL-6水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低IL-6 水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（+P＜0.01）。

4.2.3 TNF-α

與空白組比較模型組TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）、蒙藥低、中劑量組TNF-a水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低TNF-a 水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組TNF-a水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（+P＜0.01）。

4.2.4 IFN-γ

與空白組比較模型組IFN-γ水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）、陽性組、蒙藥組IFN-γ水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#P＜0.01）；與模型組比較陽性組、蒙藥組均顯著降低IFN-γ水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.01）；與陽性組比較蒙藥低劑量組，中劑量組IFN-γ水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（+P＜0.01）。

4.3 肝臟病理形態(tài)學(xué)結(jié)果

鏡下模型組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂、肝索形態(tài)不清晰、肝細(xì)胞腫脹變形，大部分彌漫性中度至重度氣球樣水腫、偶可見肝細(xì)胞輕度脂肪變性，匯管區(qū)可見不同程度的細(xì)胞浸潤，竇內(nèi)皮輕到中度增生以及不同程度的膽管增生，鏡下視野可見彌漫性大片狀及橋接樣壞死為主，可見多處核固縮，溶解，碎裂。給旺-9味組肝組織鏡下：肝板排列，肝索形態(tài)未見明顯好轉(zhuǎn)、低劑量水腫程度無明顯改善，中劑量和高劑量組肝細(xì)胞水腫較其它組減輕多數(shù)以輕度水腫為主，高、中劑量組脂肪變性較模型組減輕，匯管區(qū)周圍炎細(xì)胞浸潤減輕，偶見竇內(nèi)皮增生，高中低劑量組膽管增生均明顯改善，低劑量組肝細(xì)胞壞死仍有橋接壞死及碎片狀壞死，中、高劑量組壞死區(qū)域明顯改善以點(diǎn)狀壞死和碎片狀壞死為主，高劑量組鏡下視野多見彌漫性出血，中劑量組偶見。總結(jié)：蒙藥組可明顯減輕肝組織細(xì)胞水腫，炎癥變性，壞死表現(xiàn)，蒙藥高劑量組肝細(xì)胞壞死程度最輕。

5 討論

表2 各組大鼠肝臟中的IL-2、IL-6、TNF-a、IF-γ（±s，n= 12）

表2 各組大鼠肝臟中的IL-2、IL-6、TNF-a、IF-γ（±s，n= 12）

注：#P ＜0.01vs blank group；*P ＜0.01，*P ＜0.05 vs model group；+P ＜0.01 vs control group

組別空白組模型組陽性組低劑量組中劑量組高劑量組IL-2/（pg·mL-1）114.351±5.112226.457±55.458#121.084±15.712*186.806±13.689#*+153.142±19.253#*+123.965±28.046*IL-6/（pg·mL-1）96.226±2.906141.856±8.201#99.849±6.377*134.2±12.813#*+127.30±8.996#a+100.679±10.421*TNF-a/（pg·mL-1）172.020±34.984582.471±86.011#202.329±28.998*466.28±57.097#*+262.72±37.774#*+198.139±3.922*IFN-γ（pg·mL-1）97.084±14.000243.822±8.594#116.629±14.944#*196.928±7.275#*+152.888±3.750#*+123.948±8.122#*

ALF 的病理損傷涉及過度免疫，炎癥性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的激活，肝細(xì)胞的凋亡和壞死，脂質(zhì)過氧化反映等在內(nèi)的多種機(jī)制。本研究中采用的D-GlaN 誘導(dǎo)急性肝臟衰竭模型通過能量耗竭、鈣離子內(nèi)流、破壞肝細(xì)胞膜的完整性而引起肝臟原發(fā)性損傷,還可以促進(jìn)內(nèi)毒素的產(chǎn)生，激活肝臟的Kupffer 細(xì)胞，導(dǎo)致一系列炎癥因子的釋放，炎癥因子的過度表達(dá)引起肝臟二次打擊[12]可以促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，引起肝臟的過氧化增強(qiáng)、代謝紊亂[13-16]加重肝臟損害，最后導(dǎo)致肝細(xì)胞大量死亡，炎性細(xì)胞浸潤，微循環(huán)障礙等肝臟的三重打擊，符合急性肝功能衰竭的臨床表現(xiàn)、病理變化、生化、凝血功能等[17]。肝功能檢查血清轉(zhuǎn)氨酶的變化是反映肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)，其中普遍以ALT、AST作為觀察指標(biāo)，ALT在肝臟中的含量最豐富，AST屬細(xì)胞內(nèi)功能酶，肝細(xì)胞受損或壞死后ALT、AST 釋放入血中[18]。血清中的ALT、AST 升高時(shí)，肝臟組織的ALT、AST 活力下降，進(jìn)而肝細(xì)胞代謝發(fā)生一系列障礙，即大量的肝細(xì)胞壞死導(dǎo)致的免疫功能失調(diào)往往會(huì)對(duì)肝臟進(jìn)行第二次打擊，進(jìn)一步加重肝損傷。本研究肝功結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型組血清ALT、AST 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組織形態(tài)學(xué)結(jié)果中模型組鏡下肝組織結(jié)構(gòu)紊亂、肝索形態(tài)不清晰、肝細(xì)胞中度至重度水腫、細(xì)胞浸潤、膽管增生，彌漫性大片狀及橋接樣壞死為主，多處核固縮，溶解，碎裂等，以上提示造模成功。ALF 的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，被多數(shù)學(xué)者支持的“二次打擊學(xué)說”還是“三重打擊學(xué)說”都貫穿整個(gè)發(fā)病過程，免疫失衡是它們持續(xù)損傷肝組織的根本原因。IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ是肝衰竭發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路較典型的免疫指標(biāo)[19，20]。本研究免疫指標(biāo)檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組肝組織細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯升高，而與模型組比較，蒙藥給旺-9 低、中、高劑量組均能顯著降低肝組織細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），與陽性組比較，蒙藥低、中劑量組IL-2、IL-6、TNF-α、IFNγ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），蒙藥高劑量組降低肝組織IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平效果與美能片接近。提示蒙藥給旺-9可顯著降低D-GlaN 所誘導(dǎo)的ALF 模型大鼠肝組織細(xì)胞因子IL-2、IL-6、TNFα、IFN-γ。病理形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示蒙藥組較模型組可明顯減輕肝組織細(xì)胞水腫，炎癥變性，壞死表現(xiàn)，且蒙藥高劑量組肝細(xì)胞壞死程度最輕。給旺-9味下調(diào)IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平，從源頭治療阻斷疾病發(fā)展的主要推動(dòng)機(jī)制，能夠減輕肝細(xì)胞的損傷具有明顯保肝作用，具體作用機(jī)制與調(diào)節(jié)肝組織免疫平衡，減輕其炎性反應(yīng)有關(guān)。

本研究中采用的蒙藥給旺-9 味是蒙醫(yī)治療肝熱性病經(jīng)典方，方中以牛黃為主藥，清肝熱，解毒；輔以瞿麥清血熱、鎮(zhèn)刺痛、解毒；五靈脂清肝熱、止痛、調(diào)和體素；印度獐芽菜鎮(zhèn)希拉，清熱解毒；木香調(diào)和體素，止痛，共為佐藥。使以紅花清肝熱，鎖脈；關(guān)木通清肝熱，清腑熱。諸藥合奏清肝熱之效。給旺-9具有蒙藥方劑多成分、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)性的共性特點(diǎn)，本研究為其后續(xù)作用機(jī)制研究提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為揭示肝衰竭的發(fā)病機(jī)制提供新的思維方式并使其更好地應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。