胡雯，康曉靜

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）臨床表現(xiàn)為局部皮膚或黏膜出現(xiàn)良性疣狀增生及贅生性皮損，由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染的一種性傳播疾病[1-3]。尖銳濕疣生長(zhǎng)迅速，具有高復(fù)發(fā)性及傳染性[4,5]，還存在不易察覺(jué)的亞臨床感染狀態(tài)，較難治愈，不僅給患者及其家屬帶來(lái)精神上和經(jīng)濟(jì)上的沉重負(fù)擔(dān)，而且嚴(yán)重影響患者的身體健康。不同的HPV 型別在一定程度上決定了其感染部位、組織病理特征、臨床表現(xiàn)及相應(yīng)病程[6-8]。本文對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科就診的尖銳濕疣患者采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)HPV 感染，并對(duì)比研究了3種取材方法的檢出率，有助于了解相關(guān)HPV 病毒亞型在尖銳濕疣患者中的分布，對(duì)尖銳濕疣患者的準(zhǔn)確診斷、治療效果、預(yù)防等具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 資料來(lái)源收集新疆烏魯木齊地區(qū)2016年12月—2018年6月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科門診就診的277例尖銳濕疣患者上皮細(xì)胞和組織標(biāo)本。277例患者中男207例，女70例，漢族患者228例，維族患者49例，年齡19～81歲，平均年齡34.53歲，其中＜20歲20例，20～29歲112例，30～39歲53 例，40～49歲55 例，50～59歲26 例，＞60歲11例，并對(duì)277例患者標(biāo)本進(jìn)行了HPV 分型檢測(cè)。

1.1.2 儀器與試劑HPV 基因分型檢測(cè)試劑盒(潮州凱普生物化學(xué)有限公司)，可同時(shí)檢測(cè)23 種基因型，包括16 種高危型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82）和7 種低危型（HPV6、11、42、43、44、53、81）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀Rotor-Gen 5 Plex+HRM（南京愛(ài)楷能生物科技有限公司），生物安全柜BHC-1300IIA2[阿爾泰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（北京）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 ①刮取法：刮取女性宮頸上皮細(xì)胞（男性生殖道分泌物），用無(wú)菌棉拭子在女性宮頸（男性尿道口內(nèi)）取分泌物置無(wú)菌管中送檢；②疣體涂擦法：用一次性注射器將疣體刺破后，再用棉拭子反復(fù)擦拭病灶處以獲得足量的脫落細(xì)胞；③疣體微創(chuàng)采集法：將確認(rèn)的疣體表面擦洗干凈，應(yīng)用眼科活檢鑷從疣體組織中取體積1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 組織標(biāo)本，置1.0 ml無(wú)菌生理鹽水中送檢。

1.2.2 HP NA提取按HPV分型檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟操作提取DNA模板。其中，凱普一步法核酸提取試劑盒提取宮頸和尿道口以及疣體表面脫落細(xì)胞標(biāo)本DNA；凱普三步法核酸提取試劑盒提取組織標(biāo)本DNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)本研究基于多重?zé)晒釶CR技術(shù)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀，進(jìn)行同步核酸擴(kuò)增與檢測(cè)。分成6個(gè)反應(yīng)管，通過(guò)儀器4種熒光檢測(cè)通道，從而對(duì)23種HPV基因型進(jìn)行分型檢測(cè)，及對(duì)細(xì)胞內(nèi)對(duì)照β-globi NA檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)對(duì)照DNA用于評(píng)估樣本質(zhì)量及PCR抑制因素。

1.2.4 結(jié)果判斷檢測(cè)結(jié)果判斷嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。樣本的Ct值顯示為Undet，判斷為陰性；樣本的Ct值≤40，判斷為陽(yáng)性；若為40＜Ct值＜45的樣本建議重做，重做結(jié)果Ct值＜40者為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況及基因型分布

277例標(biāo)本中HPV 檢測(cè)陽(yáng)性者219例，陽(yáng)性率為79.06%。陽(yáng)性率居前4位的HPV 亞型分別為HPV6型（90/219）、11型（12/219）、16型（12/219）、42型（3/219），維漢以及男女患者之間HPV 陽(yáng)性檢出率相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPV 感染主要是單一感染，多重感染則主要見(jiàn)于二重感染，其中，男、女患者二重感染差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.675，P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 HPV陽(yáng)性尖銳濕疣患者亞型分布

2.2 各年齡段HPV 感染情況

檢出的219例陽(yáng)性標(biāo)本中，單一感染陽(yáng)性率高于多重感染陽(yáng)性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單一HPV 感染者為140例（50.54%），多重HPV 感染者79例（28.52%）。20～29歲組陽(yáng)性率最高，為86.23%，其次30～39歲和40～49歲的陽(yáng)性率分別為83.01%和76.36%，見(jiàn)表2。

表2各年齡段HPV感染分布情況[n(%)]

2.3 3種不同方法取材檢測(cè)結(jié)果

用刮取分泌物法、疣體涂擦法和微創(chuàng)取疣體新鮮組織3種方法對(duì)HPV 檢出率分別為75.78%、76.15%和92.86%，其中刮取法與涂擦法HPV 檢出率相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.327，P＞0.05），刮取法和涂擦法與微創(chuàng)法對(duì)HPV 檢出率相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.004，P＜0.05；χ2=5.456，P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 3種方法取材檢測(cè)HPV-DNA的結(jié)果比較

3 討論

尖銳濕疣臨床表現(xiàn)為局部皮膚或黏膜出現(xiàn)良性疣狀增生及贅生性皮損，其潛伏期通常平均3個(gè)月左右，短者3周，長(zhǎng)者＞6個(gè)月。本病流行于全世界，是目前歐美及非洲國(guó)家最常見(jiàn)的性傳播疾?。⊿TD）之一[6]。尖銳濕疣在我國(guó)的發(fā)病率較高，近年迅速增加，給患者及其家屬帶來(lái)精神上和經(jīng)濟(jì)上的沉重負(fù)擔(dān)[7]，具有嚴(yán)重的社會(huì)危害性，成為僅次于淋病的第二大性傳播疾病[8]。尖銳濕疣與HPV 感染有關(guān)，目前已知的HPV 類型有200多種，其中有40余種亞型可經(jīng)性接觸感染泌尿生殖道，導(dǎo)致尖銳濕疣等皮膚病變。

在本研究中所采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)HP NA 可以鑒定感染的HPV 具體型別以及多型別的混合感染，該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，且不受樣本純度、樣本是否存活及樣本類型等方面的影響，從而解決不易培養(yǎng)微生物的鑒定問(wèn)題。本研究中277例標(biāo)本中HPV 檢出率為79.06%，感染型別以低危型6/11型為主要型別，與陳冬蓮[8]及肖子娥和黃捷[9]的報(bào)告一致。感染以低危型別單一感染為主，多重感染則主要見(jiàn)于二重感染，維漢以及男女患者之間HPV 陽(yáng)性檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明民族和性別的差異并不會(huì)影響其檢出率。HPV 檢測(cè)結(jié)果各年齡段之間的陽(yáng)性率以20～29歲組陽(yáng)性率最高，其次為30～39歲、40～49歲年齡段，可能與性行為習(xí)慣及免疫系統(tǒng)等因素有關(guān)。用刮取分泌物、疣體涂擦法和微創(chuàng)取疣體新鮮組織法進(jìn)行取樣，微創(chuàng)法與刮取法和涂擦法相比，微創(chuàng)法對(duì)HPV 檢出率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與李榮敏等[10]結(jié)果一致，說(shuō)明微創(chuàng)法可作為診斷尖銳濕疣的首選方法。但毛雨等[11]對(duì)尖銳濕疣患者用棉拭子摩擦疣體表面進(jìn)行HP CR 分型檢測(cè)，結(jié)果表明其與微創(chuàng)法相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并具有高敏感性，同時(shí)無(wú)明顯創(chuàng)傷性，可代替既往的切除或鉗取疣體。研究結(jié)果不同可能原因是無(wú)論直接取疣體組織，還是疣體表面脫落細(xì)胞，均有部分患者出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，一方面可能是未能提取到足夠的HP NA 模板，另一方面可能是該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的23型以外HPV 感染所致以及存在個(gè)體差異因素。在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步加大樣本量，對(duì)尖銳濕疣同一患者采用不同的取材方法將HPV 陽(yáng)性率進(jìn)行比較研究，這對(duì)于不同的患者人群，針對(duì)自身情況選擇最優(yōu)的取材方法，可更大程度的提高診斷的準(zhǔn)確性具有一定的臨床意義。