吳祎培，張 羽，陳 曦，馮希平

齲病是造成嬰幼兒牙齒疼痛及牙齒缺失的主要原因之一。由于兒童生長發(fā)育和牙齒生理與解剖的特點(diǎn)，致使兒童齲病與成人相比病損波及范圍更廣泛，進(jìn)展更迅速，危害更大。2017年第四次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國5歲兒童的患齲率為70.9%，與10年前相比呈上升趨勢[1]。

微生物因素被普遍認(rèn)為是齲病的發(fā)生發(fā)展中一個(gè)重要因素[2]。齲病發(fā)生后，口腔內(nèi)的部分細(xì)菌對(duì)不斷變化的環(huán)境有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，從而成為優(yōu)勢菌群[3-4]，同時(shí)唾液組成的變化也影響著口腔微生物群的平衡失穩(wěn)[5-6]。本次研究基于MiSeq測序平臺(tái)構(gòu)建口腔微生物的16s rRNA基因文庫進(jìn)行高通量測序，旨在對(duì)不同齲易感性母親的嬰兒在不同時(shí)期的唾液微生物組群多樣性特征進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)表征和比較，觀察微生物多樣性的差異及變化，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)微生物多樣性與嬰幼兒齲病之間的關(guān)系，為預(yù)測低齡兒童齲提供一定的依據(jù)，也為早期兒童齲病的預(yù)防與預(yù)測提供健康指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象的選擇

對(duì)2016年8月份至2017年11月份在上海市浦東新區(qū)惠南鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心兒童保健科建卡妊娠期女性篩查隨訪。納入嬰兒及其母親共10對(duì)，根據(jù)嬰兒1個(gè)月月齡(1月齡)時(shí)對(duì)母親的齲病臨床檢查結(jié)果分為母親有齲組(7對(duì))與母親無齲組(3對(duì))，其中男性嬰兒6例，女性4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：母親及嬰兒無系統(tǒng)性疾病以及先天性疾??；母親口腔除齲病外無其他疾??；嬰兒為足月生產(chǎn)兒；嬰兒及母親1月齡至6個(gè)月齡(6月齡)隨訪前兩周內(nèi)未使用抗生素；嬰兒出生后未接受任何口腔治療。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過該研究(倫理批號(hào)：2015-135)，自愿參與該研究的嬰兒母親均簽署知情同意書。

1.2 口腔臨床檢查與唾液樣本的收集

母親的口腔臨床檢查主要包括恒牙牙冠狀況、可視菌斑、牙齦探診出血、牙周袋深度及附著喪失?？谇慌R床檢查由一名經(jīng)培訓(xùn)的檢查者完成。在調(diào)查實(shí)施前，按照WHO《口腔健康調(diào)查基本方法》第5版[7]中的齲病標(biāo)準(zhǔn)和釉質(zhì)發(fā)育缺陷標(biāo)準(zhǔn)，由參考檢查者對(duì)檢查者進(jìn)行齲病和牙周檢查標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)。

所有受試者要求取樣前1小時(shí)禁止進(jìn)食及飲水，嬰兒唾液樣本的收集使用無菌棉簽提取嬰兒口內(nèi)的唾液，4～5根完全浸濕的棉簽，保存至提前準(zhǔn)備好的滅菌后的5 mL離心管中。所取唾液樣品立刻置于干冰內(nèi)，確保3 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。兩組受試者于1月齡時(shí)及該嬰兒6月齡隨訪時(shí)分別收集唾液樣本。

1.3 微生物多樣性分析

所有樣本經(jīng)過總基因組DNA樣本制備及PCR擴(kuò)增構(gòu)建測序文庫，MiSeq測序平臺(tái)測序并對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)控過濾校正得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。在97%的序列相似水平下進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)的聚類劃分并完成生物信息統(tǒng)計(jì)，獲得樣本在不同的分類學(xué)水平下群落組成信息。

1.4 測序結(jié)果分析

采用Alpha多樣性分析(Shannon指數(shù))反映嬰兒在1月齡至6月齡時(shí)口腔內(nèi)物種群落豐度和多樣性豐富的變化。通過Venn圖表現(xiàn)各組樣本中的物種OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。通過Beta多樣性分析 (主成分分析，principal component analysis，PCA)分析了解樣本間物種組成的相似程度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 軟件(version23.0，IBM,美國) 比較兩組口腔臨床檢查數(shù)據(jù)的差異，計(jì)量資料采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 Fisher’s 精確檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床檢查結(jié)果

對(duì)無齲組與有齲組母親進(jìn)行的口腔臨床檢查結(jié)果如表1所示，無齲組與有齲組母親在齲失補(bǔ)指數(shù)與齲失補(bǔ)牙面數(shù)存在顯著性差異。而無齲組與有齲組母親的牙齦指數(shù)與牙周探診深度均無明顯差異。

表1 無齲組與有齲組母親口腔臨床檢查情況比較

2.2 OTU分布分析

以Venn圖統(tǒng)計(jì)多組樣本中OTU的數(shù)目及分布情況(圖1)。有齲組OTU的數(shù)目總體高于無齲組。由下圖可看出無齲組1月齡、無齲組6月齡、有齲組1月齡、有齲組6月齡4組嬰兒OTUs(OTU的種類)分別有106、142、609、392種，其中無齲組1月齡至6月齡共有種類為64種，有齲組1月齡至6月齡共有種類為322種，1月齡時(shí)無齲組與有齲組之間共有種類為89種，6月齡時(shí)無齲組與有齲組之間共有種類為123種。

2.3 Alpha多樣性分析

為反映不同樣本中微生物群落的多樣性，我們通過Shannon指數(shù)分析得到各樣本Alpha多樣性柱狀圖，無齲組在1月齡至6月齡期間口腔內(nèi)微生物多樣性均有了不同程度的增長，有齲組雖然組內(nèi)同月齡下口腔內(nèi)微生物多樣性有所差異，但在1月齡至6月齡期間口腔微生物的多樣性均有增加。1月齡時(shí)有齲組嬰兒口腔內(nèi)微生物多樣性總體高于無齲組，6月齡時(shí)有齲組嬰兒口腔內(nèi)微生物多樣性總體也高于無齲組。

negative1代表1月齡無齲組，positive1代表1月齡有齲組，negative6代表6月齡無齲組，positive6代表6月齡有齲組

A：無齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Venn圖；B：有齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Venn圖；C：1月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Venn圖；D：6月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Venn圖

圖14組受試者OUT分布Venn圖

Fig.1Venn plot of OUT distribution of subjects of four groups

negative1代表1月齡無齲組；positive1代表1月齡有齲組；negative6代表6月齡無齲組；positive6代表6月齡有齲組

A：無齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖；B：有齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖；C：1月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖；D：6月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖

圖2各組受試者Alpha多樣性(Shannon指數(shù))

Fig.2Comparison of Shannon microbial diversity index in each group

2.4 Beta多樣性分析及比較

OTU水平下比較各組的Beta多樣性可見，無齲組各個(gè)樣本1月齡時(shí)較聚集，6月齡時(shí)較分散，無齲組在1月齡至6月齡時(shí)組內(nèi)物種組成有較大差異(圖3A)；有齲組在1月齡與6月齡時(shí)在圖中的點(diǎn)均較分散，可見有齲組各樣本間在不同時(shí)期物種組成組內(nèi)均差異較大，且這種差異從1月齡時(shí)就開始體現(xiàn)(圖3B)；1月齡有齲組與1月齡無齲組各樣本反映在圖中的點(diǎn)多數(shù)聚集在同一區(qū)域，此時(shí)多數(shù)樣本的微生物物種組成較為相似(圖3C)；而至6月齡時(shí)，無齲組與有齲組各樣本不同組別間的物種組成已經(jīng)開始發(fā)生了變化(圖3D)。

negative1代表1月齡無齲組；positive1代表1月齡有齲組；negative6代表6月齡無齲組；positive6代表6月齡有齲組

A：無齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液PCA分析;B：有齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液PCA分析;C：1月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液PCA分析;D：6月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液PCA分析

圖3受試者PCA分析

Fig.3Principal component analysis of the genus information

本研究由于無齲組與有齲組之間人數(shù)不等，故可通過PLS-DA進(jìn)行比較分析，進(jìn)一步了解兩組間微生物的物種構(gòu)成與物種的相似性。通過PLS-DA在OTU水平下的分析可得到圖4，圖中每個(gè)點(diǎn)即代表一個(gè)樣本，如樣本物種組成越相似，點(diǎn)與點(diǎn)反映在PCA圖中的距離越近。圖中可看出無齲組1個(gè)月與無齲組6個(gè)月部分樣本在圖中所反映的點(diǎn)較密集，即組內(nèi)各樣本間物種組成較相似，有齲組1個(gè)月與有齲組6個(gè)月在圖中所反映的點(diǎn)較分散，組內(nèi)各樣本間物種組成差異較大。

3 討 論

當(dāng)前，低齡兒童患齲率居高不下。在齲病的病因?qū)W說中，“生態(tài)菌斑假說”這一理論得到了越來越多的學(xué)者們的認(rèn)同[8-9]，細(xì)菌是齲病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素[10 ]，迄今為止還沒有一種有效的方法可以提前預(yù)見或控制該疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究分別通過對(duì)1月齡與6月齡時(shí)嬰兒唾液中的微生物多樣性分析，縱向觀察嬰兒期口腔內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)及微生物豐度，為了解低齡兒童齲(early chil-dhood caries，ECC)的病因和發(fā)病機(jī)制提供了更廣泛的視角，為低齡兒童齲口腔菌群多樣性變化的縱向研究提供相關(guān)信息，為兒童齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)測提供理論依據(jù)。

positive1代表有齲組1月齡；positive6代表有齲組6月齡；negative1代表1月齡無齲組；negative6代表6月齡無齲組

圖4PLS-DA分析圖

Fig.4Partial least squares discriminant analysis

在相似水平為97%的OTU水平下，無齲組1月齡、有齲組1月齡的OTUs分別為106與609種，而在無齲組6月齡與有齲組6月齡中OTUs為142與392種，同月齡時(shí)相比較有齲組OTU的數(shù)目總體高于無齲組。Alpha多樣性分析中發(fā)現(xiàn)有齲組與無齲組在1～6個(gè)月的過程中各組的物種豐度均有了不同程度的增長。有多項(xiàng)研究表明，患有ECC的兒童與無齲兒童相比，口內(nèi)生物多樣性存在著顯著的差異[10-11]，無齲兒童口腔中微生物多樣性明顯高于ECC兒童，ECC組在齲發(fā)生前微生物多樣性呈明顯下降趨勢[12-14]。Tao等對(duì)于患有ECC的嬰兒口腔微生物多樣性的縱向研究中，32個(gè)月時(shí)有齲組微生物的物種豐度顯著低于無齲組。這可能是由于在兒童生命的早期階段，口腔內(nèi)物種多樣性呈一個(gè)上升趨勢[15-16]，牙齒萌出后，在唾液的影響下，優(yōu)勢菌群的數(shù)量逐漸增加[17-19]，致齲細(xì)菌在牙齒表面定殖并形成口腔生物膜的一部分，他們可能會(huì)隨著時(shí)間的推移變得相對(duì)穩(wěn)定從而影響其他微生物的物種豐度，進(jìn)而導(dǎo)致微生物多樣性的下降[20-21]。

為了比較樣本間微生物組成結(jié)構(gòu)與群落之間的差異，我們通過PCA分析了解樣本間物種組成的相似程度。OTU水平下的PCA分析顯示無齲組在1月齡時(shí)樣本間物種組成并無顯著性差異，但在1月齡至6月齡的過程中物種組成有差異性變化；而有齲組1月齡與6月齡各樣本間物種組成差異較大，且這種差異從1月齡時(shí)就開始體現(xiàn)。這表明無齲組相較于有齲組在物種組成及群落結(jié)構(gòu)方面更穩(wěn)定。

本研究同樣也存在不足與一定的局限性。如樣本量較少導(dǎo)致研究結(jié)果可能存在偏倚，對(duì)口腔內(nèi)微生物多樣性的變化不能做到全面、辯證的認(rèn)識(shí)；此外，此次研究沒有對(duì)影響齲病發(fā)生發(fā)展的變異鏈球菌等進(jìn)行針對(duì)性檢測。本研究結(jié)果作為縱向研究的一部分，后續(xù)也將繼續(xù)對(duì)更高月齡的嬰兒唾液樣本中微生物群落構(gòu)成與豐度隨訪及分析，而對(duì)于重要致齲菌-變異鏈球菌的檢測及觀察其變化等將在后續(xù)研究中涉及。