譚婉燕 李凝旭

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，是導致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。有數(shù)據(jù)顯示，2018年全世界CRC的新發(fā)病例超過180萬，死亡人數(shù)約為88.1萬，分別高居所有惡性腫瘤的第3位和第2位[2]。目前研究證實，CRC的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因的多階段、多步驟的復雜過程，原癌基因的激活和抑癌基因的失調(diào)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。微纖維相關(guān)蛋白2(microfibril-associated protein 2，MFAP2)作為一種細胞外基質(zhì)蛋白，其可與原纖維蛋白相互作用以調(diào)節(jié)微纖維的功能，在肥胖癥，糖尿病和骨質(zhì)疏松癥中扮演重要角色[4]。近年來，MFAP2在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸引起人們的重視。有研究表明，MFAP2在頭頸部鱗狀細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤和胃癌中顯著上調(diào)，發(fā)揮促癌基因的功能，參與腫瘤細胞的各種生命活動[5-7]。本研究旨在檢測MFAP2在CRC細胞及組織中的表達情況，并分析其與CRC病人臨床病理特征及預后的相關(guān)性。

對象與方法

一 、對象

2013年1月～2014年4月我院住院并接受手術(shù)治療的CRC病人組織標本65例。納入標準：術(shù)前未接受放化療；病理檢查證實為CRC；臨床資料完整，具有5年隨訪資料。男性38例，女性27例，年齡36～74歲，平均年齡(60.21±10.14)歲，根據(jù)第7版國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標準：Ⅰ期6例，Ⅱ期28例，Ⅲ期31例。術(shù)中收取組織標本包括癌及其配對的癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)，所有標本分成兩份：一份放入液氮并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存用于總RNA的提取；另一份放入10%的福爾馬林溶液中固定用于免疫組化切片染色。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有病人均簽署知情同意書。

二、方法

1.主要試劑與儀器：主要試劑：胎牛血清(美國Gibco公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，熒光定量PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)，鼠抗人MFAP2多克隆抗體(英國Abcam公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(英國Abcam公司)。引物由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，MFAP2基因上游引物：5＇-CCCAAGCTTGTGAGGAACAGTACCCGT-3＇，下游引物：5＇-CGGAATTCGATACTCCCCCAACCCGA-3＇；GAPDH基因上游引物：5＇-GCACCACCAACTGCTTAGCA-3＇，下游引物：5＇-GTCTTCTGGGTGGCAGTGATG-3＇。主要儀器：組織切片機(德國Leica公司)，漂烘片機(德國Leica公司)，PCR儀(美國Bio-rad公司)，低溫離心機(賽默飛世爾公司)，微量加樣器(德國Eppendorf公司)，免疫印跡(Western-blot)電泳儀(美國Bio-rad公司)，ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

2.細胞培養(yǎng)：人結(jié)直腸癌細胞株(HCT116，SW480)及正常結(jié)直腸上皮細胞(NCM460)均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，2～3天傳代1次。

3.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)：Trizol法提取細胞及組織中RNA，-80℃冰箱保存。取1 μg RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)，加入SYBR green染料(Qiagen)進行PCR擴增。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應的條件為：95℃預變性30秒，之后95℃ 5秒，60℃ 30秒，共40個循環(huán)后進行溶解曲線檢測，數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法。

4.Western blot：細胞培養(yǎng)48小時后，吸棄上清液，收集細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，應用BCA試劑盒對蛋白濃度進行檢測。配制10%分離膠和5%濃縮膠，電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，置于鼠抗人MFAP2抗體(1∶3000稀釋)或鼠抗人GAPDH(1∶1000稀釋)中4℃孵育過夜孵育結(jié)束后，洗膜，再滴加兔抗鼠二抗室溫搖床孵育1小時，再洗滌。將洗滌千凈的PVDF膜置于ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)儀器中掃膜，用Image Lab軟件系處理圖像即得到最終結(jié)果。

5.免疫組織化學染色：采用免疫組化SP法對切片進行染色。具體操作如下：取4 μm厚組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，3% H2O2去離子水(無色液體)孵育10～30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。山羊血清封閉15～30分鐘，孵MFAP2一抗(1∶100稀釋)，37℃孵育2～3小時，次日滴加標記有HRP的二抗室溫孵育30分鐘，顯色劑顯色(DAB)，顯微鏡下控制反應時間。蘇木素復染，逐級脫水、透明、中性樹膠封片染色，然后使用光學顯微鏡進行閱片和結(jié)果判定。每張切片由2位資深病理專家讀片，于400倍視野下隨機選取5個不同視野，根據(jù)每個高倍鏡視野中細胞的染色強度及陽性細胞所占比例進行評分，染色評分值計算為強度染色(0：陰性，1：弱，2：中度，3：強)乘以陽性腫瘤細胞的百分比(1：1%～25%；2：26%～50%；3：51%～75%；4：≥76%)，總分≤3分為低表達，3分為高表達。

6.隨訪：采取門診復查或電話隨訪方式進行，隨訪時間截止至2019年5月，納入的65例病人均完成5年隨訪。觀察指標為總生存期(overall survival，OS)，定義為從明確診斷為結(jié)直腸癌開始至因任何原因?qū)е虏∪怂劳龅臅r間。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1.MFAP2在結(jié)直腸細胞和組織中的表達：RT-qPCR結(jié)果顯示，CRC細胞中MFAP2 mRNA的表達水平高于正常結(jié)直腸上皮細胞(P< 0.05)(圖1A)；Western blot結(jié)果表明，CRC細胞中MFAP2蛋白的表達水平高于正常細胞(圖1B)。我們進一步驗證了MFAP2在CRC組織及配對癌旁組織中的表達情況，結(jié)果顯示MFAP2 mRNA和蛋白在CRC組織中的表達水平均高于癌旁組織(P<0.05)(圖1C和1D)。

圖1 MFAP2在結(jié)直腸細胞和組織中的表達

2.MFAP2蛋白在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達：免疫組化檢測結(jié)果顯示，MFAP2蛋白主要定位于細胞質(zhì)，其在癌旁組織中的表達水平高于癌組織>(圖2)。在65例CRC病人中，癌組織中高表達MFAP2蛋白39例，占60%。

3.MFAP2表達與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征的關(guān)系見表1。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果，將65例CRC病人分為高表達(39例)和低表達組(26例)，分析MFAP2表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果表明，MFAP2蛋白高表達與腫瘤的組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及術(shù)前CEA水平無關(guān)(P>0.05)。

4.MFAP2表達與結(jié)直腸癌病人預后的關(guān)系：所有65例病人均完成隨訪，死亡34例，占所有病人的52.3%；其中，1、3、5年生存率分別為100%、76.9%、47.7%。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果表明，MFAP2高表達病人的死亡率高于低表達病人，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。進一步的單因素分析結(jié)果顯示，組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、神經(jīng)侵犯、TNM分期和MFAP2高表達是影響CRC病人預后的重要因素(P<0.05)。見表2。將單因素分析有意義的臨床病理學因素納入Cox多因素回歸模型，結(jié)果顯示脈管浸潤、TNM分期和MFAP2高表達是CRC病人的獨立預后因素(P<0.05)。見表3。

表1 結(jié)直腸癌組織中MFAP2表達水平與臨床病理特征的關(guān)系(65例)

注：aP<0.05

表2 影響CRC病人生存時間的單因素分析

注：aP<0.05

表3 影響CRC病人生存時間的Cox比例風險回歸分析

注：aP<0.05

討 論

隨著早期篩查理念的深入和包括手術(shù)、放化療及分子靶向治療等多種治療手段的發(fā)展，CRC的治療效果和臨床預后已取得明顯進步，但病人的5年生存率仍較低[1]。目前，復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是導致CRC病人死亡的主要原因[3]。既往研究已證實癌基因的激活在CRC的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[3]。

MFAP2也稱為微纖維相關(guān)糖蛋白1(MAGP1)，是微纖維的主要成分[4]。目前，對MFAP2作用的研究主要集中在其對原彈性蛋白沉積到微纖維上形成彈性纖維過程的調(diào)節(jié)：Fujita等[8]研究表明，MFAP2參與了人睫狀體小腦發(fā)育過程中纖維蛋白-1的細胞外沉積中過程；體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，MFAP2缺陷的小鼠在受傷后出現(xiàn)血小板數(shù)量減少、出血時間延長和頸動脈血栓閉塞延遲，表明其在止血和血栓形成過程發(fā)揮重要作用[9]。Silveira等[5]首先通過生物信息學分析表明，MFAP2在頭頸部鱗狀細胞癌組織中顯著上調(diào)，尤其是在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中；Apostolos等研究發(fā)現(xiàn)MFAP2是與多發(fā)性骨髓瘤中NF-κB/Snail/YY1/RKIP通路最共表達的基因之一，而上述通路在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用；Wang等[7]在最近的研究中證實，MFAP2在胃癌組織中過表達，且其過表達與胃癌病人無病生存期和總生存期顯著相關(guān)。

在本研究中，我們分析了MFAP2在CRC細胞及組織中的表達水平及其與65例CRC病人臨床病理學特征和預后的相關(guān)性，結(jié)果表明，MFAP2在CRC中表達上調(diào)，且其上調(diào)表達與多種不良臨床病理特征顯著相關(guān)，預示著病人的不良預后，提示MFAP2可能在CRC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的功能。

當前，越來越多的研究已表明腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。在既往的研究中，Wang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MFAP2可通過激活TGF-β/SMAD2/3信號傳導通路調(diào)控胃癌細胞的EMT過程，從而促進細胞的增殖、遷移和侵襲；Zaravinos等[6]發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤中的MFAP2與NF-κB/Snail/YY1/RKIP通路共表達，NF-κB和Snail作為EMT的核心轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤細胞的EMT進程中扮演關(guān)鍵角色[11]，提示MFAP2可能在多發(fā)性骨髓瘤細胞的EMT調(diào)控中具有重要作用。因此，我們推測MFAP2可能通過促進腫瘤細胞的EMT過程，影響腫瘤細胞的多種生物學行為，從而發(fā)揮其促癌功能。

MFAP2在CRC中表達上調(diào)，且其高表達與病人的不良臨床病理特征及不良預后密切相關(guān)，有望成為CRC病人預后評估的新標志物和潛在的治療靶標。