李來旭，潘添博，初曉紅，李 睿

1.重慶永健生物制品有限公司，重慶 400000；2.重慶市合川區(qū)合陽城街道辦事處畜牧獸醫(yī)站，重慶400000；3.江蘇省新沂市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣中心，江蘇新沂 221400；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150000

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒（DHV）引起雛鴨的一種高度致死性的、傳播迅速的病毒性傳染病。臨床上以神經(jīng)癥狀、肝臟腫大及表面有出血為特點。該病潛伏期短，約為1 ～3 d 發(fā)病，傳播速度快。Ⅰ型鴨肝炎病毒主要侵害30 日齡內(nèi)的雛鴨，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的一種傳染病之一。

本試驗對重慶永健生物制品公司保存的Ⅰ型鴨肝炎病毒CRF98 株進(jìn)行了毒種制備及病毒含量、雞胚毒力、免疫原性、特異性和純凈性等一系列鑒定工作。檢驗結(jié)果均符合生產(chǎn)用種毒的要求，為企業(yè)提供生產(chǎn)用種毒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 Ⅰ型鴨肝炎病毒CRF98 株種毒

重慶永健生物制品公司保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 其他材料和試劑

無菌培養(yǎng)基，重慶永健生物制品有限公司制備；支原體培養(yǎng)基，購自北京中海生物科技有限公司；DMEM、新生牛血清，購自美國Hyclone公司購買。

1.2 方法

1.2.1 生產(chǎn)用種毒制備

將Ⅰ型鴨肝炎病毒CRF98 株毒種用生理鹽水稀釋至100 倍，經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚，每胚0.2 mL，置37 ℃孵育觀察120 h，棄去24 h 內(nèi)死亡雞胚，無菌收獲36 ～120 h 死亡雞胚尿囊液。

1.2.2 生產(chǎn)用種毒鑒定

1.2.2.1 病毒含量：將種毒作10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6 和10-74 個稀釋度，經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚各5 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃孵育觀察120 h，24 h 前死亡雞胚不計，記錄雞胚死亡情況，按Reed-Muench 法計算ELD50。

1.2.2.2 對雞胚毒力：將種毒用生理鹽水稀釋至200 ELD50/0.2 mL，經(jīng)尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚10 枚，每胚0.2 mL，置37 ℃孵育，并記錄雞胚在接種后24 ～120 h 的死亡和剖檢情況。

1.2.2.3 免疫原性：將病毒液經(jīng)甲醛滅活與油佐劑乳化制成免疫原，肌肉接種SPF 產(chǎn)蛋雞10 只，2.0 mL/只，同時設(shè)10 只SPF 產(chǎn)蛋雞作為生理鹽水對照。免疫后21 日采蛋，用中和試驗方法進(jìn)行卵黃抗體效價測定。

1.2.2.4 特異性：抽取待檢樣品，用生理鹽水稀釋至200 ELD50/0.2 mL，與等量Ⅰ型鴨肝炎病毒特異性陽性血清混合，置37 ℃水浴中和1 h，尿囊腔接種10 日齡SPF 雞胚，每胚0.2 mL，37 ℃孵育觀察120 h，記錄24 ～120 h 雞胚死亡情況。

1.2.2.5 常規(guī)檢驗：按照2015 版《中國獸藥典》附錄進(jìn)行無菌檢驗和支原體檢驗。

2 結(jié)果

2.1 病毒含量測定結(jié)果

用SPF 雞胚測定Ⅰ型鴨肝炎病毒CRF98 株生產(chǎn)用種毒的病毒含量，結(jié)果顯示凍干毒對雞胚的半數(shù)感染量為106.16/0.2 mL。

2.2 對雞胚測定結(jié)果

Ⅰ型鴨肝炎病毒CRF98 株生產(chǎn)用種毒凍干毒接種雞胚，可致雞胚10/10 死亡，剖檢死亡雞胚，胚體出血，肝臟出血，說明毒力穩(wěn)定。

2.3 免疫原性測定結(jié)果

生產(chǎn)用種毒接種雞胚制備的病毒液滅活后與油佐劑乳化制成免疫原，肌肉接種產(chǎn)蛋雞，免疫后2 1 日采蛋測定卵黃抗體中和效價平均值為1:325，對照組卵黃抗體效價為1:2，免疫原性良好。

2.4 特異性檢驗結(jié)果

特異性檢驗結(jié)果表明CRF98 株生產(chǎn)用種毒可被Ⅰ型鴨肝炎病毒特異性陽性血清完全中和，特異。

2.5 無菌檢驗結(jié)果

無菌檢驗結(jié)果表明CRF98 株生產(chǎn)用種毒無細(xì)菌生長。

2.6 支原體檢驗結(jié)果

支原體檢驗結(jié)果表明CRF98 株生產(chǎn)用種毒無支原體生長。

3 討論

我們對Ⅰ型鴨肝炎病毒CRF98 株生產(chǎn)用種毒進(jìn)行雞胚傳代擴(kuò)繁。經(jīng)病毒含量、雞胚毒力、特異性、免疫原性、純凈等鑒定，表明該病毒傳代穩(wěn)定，病毒含量達(dá)到要求，免疫原性較高，能夠被同型特異性陽性血清中和，無細(xì)菌和支原體污染。為疫苗生產(chǎn)提供了能長期保存且穩(wěn)定性好、高滴度的生產(chǎn)用種毒。