王 瑞, 黃雨辰, 熊德東, 黃 亞, 田 甜, 孟 彬, 梁 健, 2

Pb2+對青蛤的急性毒性及對其血淋巴液中免疫相關酶活性的影響

王 瑞1, 黃雨辰1, 熊德東1, 黃 亞1, 田 甜1, 孟 彬1, 梁 健1, 2

(1. 天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院, 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室, 天津 300384; 2. 天津市海洋牧場技術工程中心, 天津 300457)

采用靜態(tài)急性毒性實驗研究了重金屬Pb2+對青蛤()的生物急性毒性效應, 測定了在96 h Pb2+半致死濃度的1/10(TC組)和1/100(SC組)兩個濃度脅迫下, 血淋巴液中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和溶菌酶(LSZ)活性的變化。結(jié)果顯示: Pb2+的96 hLC50為7.938 mg/L; SC組ACP活性表現(xiàn)為誘導-抑制趨勢, 除4 d外均與對照組差異顯著(<0.05), TC組為抑制趨勢, 為3個組中的最低, 與對照組差異顯著(<0.05); 實驗組SC組和TC組的AKP、LSZ活性均表現(xiàn)為前期為誘導中后期受抑制的趨勢, 與對照組差異顯著(<0.05), 且TC組活性始終低于SC組, 表現(xiàn)出Pb2+的脅迫濃度越高酶活性受到的抑制作用越大。以上結(jié)果表明, 重金屬Pb2+對青蛤的毒性級別為高毒級, 能造成青蛤免疫相關酶的活性受到抑制, 影響青蛤的免疫能力, 而且這種抑制作用隨著環(huán)境中Pb2+濃度增加而增加。

青蛤(); Pb2+; 急性毒性; 免疫相關酶

鉛(Pb)是一種非常常見的有色重金屬元素, 具有難降解、難代謝、可沿食物鏈堆積和蓄積的特性, 并且污染后難以發(fā)現(xiàn)。多數(shù)學者認為Pb并非動物生長的必需元素, 而是一種對動物有累積傷害的污染物,是地球上分布最廣, 最嚴重的環(huán)境污染物之一[1]。近年來隨著經(jīng)濟的發(fā)展, 工廠含鉛廢水的排放以及廢舊電池的丟棄, 使Pb2+等重金屬離子隨著江河的沖刷作用最終進入海洋。而沿海的海洋生物, 特別是灘涂貝類會通過生物富集效應將Pb2+等重金屬離子累積在體內(nèi), 造成自身損害, 成為水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要障礙。同時隨著時間的推移以及食物鏈的傳遞作用, Pb2+會對的海洋生態(tài)系統(tǒng)以及人類的健康產(chǎn)生損害。研究Pb2+等重金屬富集效應對貝類的影響越來越受科學家的關注, 已報道有近江洋牡蠣()[2]、櫛孔扇貝()[3]、菲律賓蛤仔()[4]、四角蛤蜊()[5]、縊蟶()[6]、泥蚶()[7]。同時全國各省市也在監(jiān)測本地區(qū)海域貝類的重金屬Pb2+污染狀況, 以評估人群膳食暴露風險[8-10]。

青蛤()屬軟體動物門、瓣鰓綱、簾蛤目、簾蛤科, 民間通常稱之為黑蛤、圓蛤、鐵蛤等, 其生長速度快, 適應性強, 分布范圍廣, 種群密度大, 是重要的經(jīng)濟貝類[11]。由于沉降作用Pb2+在水體下層尤其是在底泥中含量會比較高, 而青蛤移動性差, 活動范圍較小, 長期棲息于底泥中, 且為濾食性, 其Pb2+富集量會尤為嚴重。因此, 本研究通過確定Pb2+對青蛤的半致死濃度和安全濃度, 研究這兩種濃度脅迫下青蛤血淋巴液中免疫相關酶活性的變化, 全面分析青蛤?qū)b2+應激反應機制, 進而評估重金屬Pb2+污染對青蛤的存活趨勢以及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的影響程度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用青蛤取自天津獨流減河河口區(qū), 于天津海升水產(chǎn)養(yǎng)殖公司暫養(yǎng)7 d, 期間使用沙濾海水, 鹽度25, 每天投喂小球藻()3次, 投喂量2×104cell/L, 并連續(xù)充氣。在實驗開始前24 h停止投喂, 挑選身體健康, 殼面無破損, 閉殼反應迅速、大小相似(殼長15.979 mm±0.150 mm; 殼寬17.043 mm±0.176 mm; 殼高9.862 mm±0.180 mm)的青蛤進行實驗。

1.2 急性毒性實驗

使用醋酸鉛配置實驗所需母液, 并根據(jù)預實驗結(jié)果, 參照等對數(shù)間距法[11], 設置10.00、13.90、19.05、26.30、36.30和50.12 mg/L 6組濃度梯度, 每組3個重復, 并以正常海水組為對照組, 每組放入青蛤20枚(表1)。試驗期間不投餌不充氣, 每4 h觀察各組情況, 及時挑出死亡個體并做記錄(以外套膜收縮、貝殼張開、用玻璃棒觸碰無閉殼反應做為死亡的判斷依據(jù)), 計算Pb2+的96 h半致死濃度(96 h LC50), 安全濃度為96 h LC50的1/100。每6 h測量并記錄pH值及溫度的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 21.0 軟件進行線性回歸分析, 繼而計算半致死濃度、95%置信區(qū)間和相關系數(shù)2。單因素方差分析用于方差分析, Duncan test檢驗數(shù)據(jù)的顯著性, 結(jié)果表示為: 平均數(shù)±標準差, 顯著性水平為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb2+對青蛤的急性毒性

各實驗組急性毒性實驗過程中海水溫度、pH值變化如圖1所示。各實驗組在各時間點上的水溫差異很小, 最高時相差1.3℃, 整個實驗期間溫度變化范圍為28.0~31.5℃; 各實驗組的pH值差異最大值出現(xiàn)在78 h, 為1.47; 整個試驗期間海水pH值的變化范圍為6.60~8.20; 海水鹽度為人工調(diào)制, 穩(wěn)定于25‰, 因此可認為本實驗的外界環(huán)境因子相對穩(wěn)定。

通過線性回歸線分析, 得出死亡概率單位與醋酸鉛溶度對數(shù)的相關方程為=4.77419+3.70986, 相關系數(shù)2=0.988。醋酸鉛(CH3COO)2Pb對青蛤的96 h LC50=19.360 mg/L, 95%的置信區(qū)間為17.554~21.230 mg/L, 安全濃度為0.194 mg/L, 通過換算得出Pb2+對青蛤的96 h LC50為7.938 mg/L, 安全濃度為0.0794 mg/L。

圖1 急性毒性實驗過程中海水溫度、pH值變化情況

表1 不同濃度鉛離子對青蛤的急性毒性

2.2 Pb2+對青蛤的脅迫

脅迫實驗期間各實驗組海水溫度、pH值變化如圖2所示。SC和TC實驗組在各時間點上的溫度基本一致, 與對照存在一定溫差, 最大溫差出現(xiàn)在第12 d, 差值為1.7℃, 整個實驗期間溫度變化范圍為28.3~31.3℃; 實驗組與對照組的pH值相差不大, 最大差值出現(xiàn)在11 d, 為0.28, 整個試驗期間海水pH值的變化范圍為7.67~8.27。海水鹽度為人工調(diào)制, 穩(wěn)定于25‰, 因此可認為本實驗的外界環(huán)境因子相對穩(wěn)定。

2.2.1 對酸性磷酸酶的濃度影響

由圖3可知, 與對照組相比, SC組ACP活性整體表現(xiàn)為先誘導后抑制趨勢, 除4 d時在各時間點上與對照組差異顯著(<0.05), 最低值出現(xiàn)在第10 d, 僅為(0.94±0.01)U/mg; TC組整體表現(xiàn)抑制趨勢, 整個實驗過程中均為三個實驗組中的最低, 除4 d外與對照組差異顯著(<0.05); 最低值出現(xiàn)在第10 d, 為(0.74±0.01)U/mg。

圖2 脅迫實驗期間溫度、pH值變化情況

圖3 不同Pb2+濃度脅迫對青蛤血淋巴液ACP活性的影響

注: 同一時間點上不同的字母表示組間差異顯著(<0.05), 下同

2.2.2 對堿性磷酸酶的濃度影響

如圖4所示, 脅迫的第2 d, 實驗組SC組和TC組的AKP活性出現(xiàn)短暫的誘導作用, 隨脅迫時間的推移在第4 d后就一直處于受抑制作用; SC組在受抑制期間除第8 d外均與對照組差異顯著(<0.05), 最小值出現(xiàn)在第10 d僅為(0.55±0.05) U/mg; TC組在受抑制期間均與對照組差異顯著(<0.05), 最小值出現(xiàn)在第10d僅為(0.23±0.03) U/mg。

2.2.3 對溶菌酶的濃度影響

如圖5所示, 實驗組SC組和TC組的LSZ活性在實驗前期表現(xiàn)為誘導趨勢, 中后期表現(xiàn)為抑制趨勢, 均在第4 d時產(chǎn)生最大誘導作用, 此時SC組活性最大值為3.73 U/mg, TC組為4.20U/mg; 隨后兩實驗組LSZ活性迅速被抑制, 期間兩實驗組均與對照組差異顯著(<0.05), 且TC組活性始終低于SC組; SC組LSZ活性最低值(1.23±0.01) U/mg出現(xiàn)在第6 d, TC組在第12 d時出現(xiàn)最低值(1.05±0.07) U/mg。

圖4 不同Pb2+濃度脅迫對青蛤血淋巴液AKP活性的影響

圖5 不同Pb2+濃度脅迫對青蛤血淋巴液LSZ活性的影響

3 討論

3.1 急性毒性

急性毒性實驗是指物質(zhì)在高濃度、短時期(通常為24~96 h)引起受試生物群體出現(xiàn)一定數(shù)量的死亡或者產(chǎn)生其他效應的實驗方法, 進而得出某種物質(zhì)對生物的半致死濃度和安全濃度, 為找出該物質(zhì)的作用途徑、劑量-效應關系、作用機理等其他的動物實驗提供依據(jù)支撐, 同時也可以為環(huán)境監(jiān)測提供預警值, 因而沿用至今, 成為最常用的毒理學實驗方法之一。水生動物對水環(huán)境的變化很敏感, 當水體中蓄積一定濃度有毒物質(zhì)時, 會出現(xiàn)中毒現(xiàn)象, 具體表現(xiàn)為: 索餌、生殖或者形態(tài)的改變; 遲鈍遲發(fā)性癥狀、行為反常、運動痙攣失調(diào)或游動停滯、麻痹、甚至停止攝食而死; 種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等[13]。本實驗開始時, 各個濃度組的青蛤無異常表現(xiàn), 不久后輕觸青蛤的水管個別個體收縮緩慢, 表現(xiàn)出明顯的應激現(xiàn)象。隨著作用時間的延長, 更多的個體表現(xiàn)出類似的應激反應且更加遲鈍, 嚴重者出現(xiàn)外套膜收縮、閉殼肌無力、貝殼張開等明顯的中毒表現(xiàn), 最終造成死亡。這也與海灣扇貝的鉛中毒的癥狀相一致[14]。

符修正等人[15]研究得出Pb2+對波紋巴非蛤的96 h LC50為4.119 mg/L, 毒性級別為高毒級(LC50為1~100 mg/L)。劉瓊玉等[16]進行重金屬鋅、鉛對菲律賓蛤仔的急性毒性試驗結(jié)果顯示, Pb2+對菲律賓蛤仔的96 h LC50為14.28 mg/L。本試驗研究得到Pb2+對青蛤的96 h LC50為7.938 mg/L, 安全濃度為0.0794 mg/L,毒性級別屬于高毒級。這表明即使是相同的物質(zhì), 其毒性仍然有所差異, 這可能和生物體自身的耐受性以及物質(zhì)在機體內(nèi)的代謝、作用方式有一定關系。

本試驗中青蛤Pb2+安全濃度為0.0794 mg/L, 高于中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《無公害食品海水養(yǎng)殖水質(zhì)NY5052-2001》要求的≤0.05 mg/L。但貝類對重金屬具有很強的富集作用, 當養(yǎng)殖海水水質(zhì)達標時也多加關注, 應及時采取措施, 減少不必要的損失。

3.2 Pb2+脅迫對免疫相關酶活性的影響

酸性磷酸酶(ACP)是動物代謝過程中重要的調(diào)節(jié)酶。在酸性內(nèi)環(huán)境下催化磷酸單酯水解, 參與磷酯的代謝和其他重要的生物學功能, 通常認為酸性磷酸酶主要存在于溶酶體內(nèi), 是溶酶體的標志酶之一[17]。盧斌等[18]將白氏文昌魚()分別暴露在Cd2+安全濃度的水體中7 d, 發(fā)現(xiàn)Cd2+隨時間的推移, 酸性磷酸酶的活性在第1 d、7 d高于對照組, 呈先誘導后抑制的趨勢; 白秀娟等[19]的實驗表明, 在較高濃度的重金屬暴露下文昌魚的ACP表現(xiàn)為顯著抑制; 本實驗結(jié)果與上述研究一致, 本實驗中低Pb2+濃度的SC組ACP活性整體表現(xiàn)為先誘導后抑制趨勢, 而高Pb2+濃度的TC組整個試驗期間均受到抑制。

堿性磷酸酶是一種含鋅的糖蛋白[20], 廣泛分布于動物的各個組織內(nèi), 在堿性環(huán)境中(最佳pH值約為10)可以催化各種醇和磷酸苯酚的水解[21], 對生物體的免疫作用具有重要意義。賴德榮等研究表明[22]鎘污染對翡翠貽貝()堿性磷酸酶的影響有明顯的抑制作用, 在Cb2+濃度在1~500 μg/L范圍內(nèi)就會有明顯的抑制作用, 并且與水體中的鎘濃度增加而出現(xiàn)的抑制作用且作用隨著鎘濃度的增加越來越顯著。本實驗中, SC組和TC組AKP活性在實驗前期出現(xiàn)短暫的誘導作用, 但隨后便一直受抑制作用, 且高Pb2+濃度的TC組受抑制程度要大于安全濃度的SC組。

溶菌酶(lysozyme) 又名 N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶或胞壁質(zhì)酶, 是一種小分子質(zhì)量的堿性蛋白水解酶, 是體內(nèi)最重要的非特異性免疫因子之一, 它不僅可以催化細菌細胞壁的水解, 還可以使細菌在體內(nèi)免疫過程中溶解和死亡, 誘導其他免疫因子的合成和分化, 參與機體內(nèi)多種免疫反應, 并在機體特異性免疫和非特異性免疫中發(fā)揮重要作用, 常作為評價機體免疫水平的重要指標之一[23]。貝類溶菌酶是由在研究美洲牡蠣()血淋巴液的過程中發(fā)現(xiàn)的[24]。丁鑒峰等[25]研究證實, 海洋污染物濃度對所在海區(qū)的菲律賓蛤仔血細胞的亮氨酸氨基肽酶和溶菌酶活性有顯著的抑制作用, 污染物濃度越高抑制作用越大。李曉梅等[26]研究表明, 近江牡蠣長期處于低pH、鉛脅迫或Pb2+脅迫共存的條件下, 會導致其組織溶菌酶含量降低和耐受性降低。本實驗中實驗組SC組和TC組的溶菌酶活性在實驗前期表現(xiàn)為誘導-抑制的變化趨勢, 在第4 d時產(chǎn)生最大誘導作用, 隨后兩實驗組LSZ活性迅速被抑制, 期間兩實驗組均與對照組差異顯著(<0.05)。

當外來物質(zhì)進入體內(nèi)或隨著環(huán)境的變化, 貝類溶酶體含有的各種水解酶, 如酸性磷酸酶, 堿性磷酸酶和溶菌酶, 會參與殺害和消除異物[26]。本實驗中對照組青蛤的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶或溶菌酶的活性隨時間呈先降低再升高趨勢, 可能由于青蛤體內(nèi)被異物入侵, 它們參與了體內(nèi)殺害和消除異物的過程。本實驗中青蛤在兩種Pb2+濃度(SC組和TC組)脅迫下血淋巴液中ACP、AKP和LSZ活性均出現(xiàn)先誘導后抑制的變化趨勢, 而且高Pb2+濃度的TC實驗組酶活性受到的抑制作用明顯大于低Pb2+濃度的SC實驗組; 這種促進酶活性在脅迫初期升高的現(xiàn)象可能是由于“毒性興奮效應”造成的, Stebbing[27]認為低劑量毒物可以引起一系列修復和維持機制, 例如通過激活轉(zhuǎn)錄因子和激酶, 增加細胞保護和修復蛋白(例如, 抗氧化酶, 伴侶蛋白, 生長因子, 免疫因子等), 稱為“毒物興奮作用”。但隨著脅迫時間的延長以及有毒物質(zhì)濃度的增大, 毒物會改變血細胞內(nèi)溶酶體膜的通透性、減少修復性蛋白表達量甚至引起血細胞溶解, 導致溶酶體失活及酶合成量減少, 造成酶活性受抑制。

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Acute Pb2+toxicity inand its effect on immune-related enzyme activity in hemolymph

WANG Rui1, HUANG Yu-chen1, XIONG De-dong1, HUANG Ya1, TIAN Tian1, MENG Bin1, LIANG Jian1, 2

(1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, Department of Fishery Sciences, Tianjin Agri-cu-ltural College, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Marine Ranching Technical Engineering Center, Tianjin 300457, China)

Acute lead toxicity has emerged as a serious environmental and health concern in China. The present study aimed to evaluate the effects of acute Pb2+toxicity onusing static acute toxicity test. Effects of Pb2+on the activity of three immune-related enzymes—acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP), and lysozyme (LSZ)—present in hemolymph were studied under stress concentration of 1/10 (TC group) and 1/100 (SC group) of LC50at 96 h. The results of the study indicated that LC50of Pb2+was 7.938 mg/L at 96 h post exposure. The activity of ACP in the SC group showed an induction–inhibition trend that was significantly different from the control group, except for 4 days (<0.05).The inhibition trend for ACP in the TC group was significantly different from the control group and was the lowest among the three groups (<0.05). For both the SC and TC groups, the activities of AKP and LSZ were significantly induced in early stage, followed by inhibition in middle and late stages of lead exposure. This trend was significantly different from that of the control group (<0.05), and the activity reported in the TC group was lower than that in the SC group at all stages. The results of this study indicated that high Pb2+toxicity inwas accompanied by the inhibition of immune-related enzymes, thereby affecting the immunity in barley. Therefore, the inhibition of enzyme activity inincreased with the increase in the stress concentration of Pb2+.

; Pb2+; acute toxicity; immune-related enzyme

Jul. 14, 2019

S917.4

A

1000-3096(2020)03-0059-07

10.11759/hykx20190714002

2019-07-14;

2019-11-20

天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201810061254); 天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目(201903010); 國家貝類產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-49); 國家重點研發(fā)計劃“藍色糧倉科技創(chuàng)新”項目(2018YFD0901404); 天津市種業(yè)科技重大專項(17ZXZYNC00020); 天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊(ITTFRS2017013)

[Tianjin University Students Innovation and Entrepreneurship Training Program, No. 201810061254; Tianjin Agricultural Science and Technology Achievements Transformation and Promotion Project, No. 201903010; National Shellfish Industry Technology System Project, No. CARS-49; National Key R&D Program “Blue Granary Technology Innovation” Project, No. 2018YFD0901404; Tianjin Seed Industry Science and Technology Major Project, No. 17ZXZYNC00020; Tianjin Aquatic Industry Technology System Innovation Team, No. ITTFRS2017013]

王瑞(1997-), 女, 吉林永吉人, 本科生, 主要從事貝類遺傳育種研究, 電話: 15900256672, E-mail: 1227435023@qq.com; 梁健,通信作者, 實驗師, E-mail: liangjian@tjau.edu.cn

(本文編輯: 康亦兼)