李 炳, 王瑞旋, 謝燕純, 舒 琥, 牟紅莉, 郭子晗, 王江勇

廣東沿海香港牡蠣消化道異養(yǎng)菌統(tǒng)計(jì)及其耐藥性研究

李 炳1, 3, 王瑞旋1, 2, 謝燕純4, 舒 琥4, 牟紅莉3, 郭子晗5, 王江勇1, 3

(1. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)), 上海 201306; 2. 韓山師范學(xué)院, 廣東 潮州 521041; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所, 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510300; 4. 廣州大學(xué), 廣東 廣州 510006; 5. 加利福尼亞浸會(huì)大學(xué), 美國(guó) 加利福尼亞 92504)

本研究針對(duì)高溫時(shí)期(6月、9月)廣東沿海地區(qū)的香港牡蠣()體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)進(jìn)行了深入的調(diào)查, 并由添加單種抗生素(分別是: 慶大霉素、呋喃唑酮、利福平、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明)的培養(yǎng)基中分離得到310個(gè)菌株。進(jìn)一步采用紙片擴(kuò)散法(kirby-bauer法)針對(duì)常見的抗生素對(duì)此310個(gè)菌株進(jìn)行藥敏測(cè)試, 了解不同來源菌株的耐藥狀況。結(jié)果表明310個(gè)菌株分屬48個(gè)不同種屬, 主要是腸桿菌()、弧菌()、芽孢桿菌()、肺炎克雷伯菌()、希瓦氏菌()、不動(dòng)桿菌()、假單胞菌()、短波單胞菌()、發(fā)光桿菌()、黃桿菌()、鹽單胞菌()等。在9月份從牡蠣體內(nèi)分離的異養(yǎng)細(xì)菌比6月份分離的異養(yǎng)細(xì)菌高出1~2個(gè)數(shù)量級(jí)(除臺(tái)山外)。6月份從臺(tái)山地區(qū)牡蠣分離的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)(2.6×106~5.8×106cfu/g)最多, 高出其他地區(qū)1~3個(gè)數(shù)量級(jí)。藥敏測(cè)試結(jié)果顯示牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)20種抗生素普遍存在抗性, 尤其對(duì)青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素表現(xiàn)出較高的耐藥率。高溫時(shí)期(6月、9月)分離的異養(yǎng)菌大多數(shù)為多重耐藥細(xì)菌, 其比例分別為84.18 %和91.72 % 。本研究將為牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的疾病控制以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌的耐藥狀況提供重要參考依據(jù)。

牡蠣; 異養(yǎng)細(xì)菌; 弧菌; 多重耐藥性

香港牡蠣()隸屬雙殼綱, 牡蠣科, 主要分布于華南沿海咸淡水水域, 具有明顯的地方特色, 已成為中國(guó)南部沿海最主要的牡蠣養(yǎng)殖種類[1-2]。隨著養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大以及集約化養(yǎng)殖密度的增長(zhǎng), 大規(guī)模疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也不斷增加, 而其中細(xì)菌性疾病是阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素。值得注意的是, 牡蠣大量死亡的現(xiàn)象一般出現(xiàn)在夏季, 往往水溫較高的季節(jié)和地區(qū)更為嚴(yán)重[3-4]。當(dāng)貝類體內(nèi)細(xì)菌突增或養(yǎng)殖環(huán)境惡化致使貝類體質(zhì)下降, 即可能引起細(xì)菌流行病的暴發(fā), 并導(dǎo)致貝類的大量死亡[5]。如水溫超過20℃時(shí), 牡蠣幼體更易發(fā)病, 一旦發(fā)病, 死亡率高達(dá)90%[6]。其中, 異養(yǎng)細(xì)菌扮演著重要的角色。異養(yǎng)細(xì)菌是典型的基質(zhì)限制性生物, 其個(gè)體微小、繁殖速度快、生命周期短, 異養(yǎng)細(xì)菌目前被認(rèn)為是浮游生物群落的一個(gè)重要組成部分[7], 且異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量變化可間接反映養(yǎng)殖環(huán)境理化因子的狀況[8]。

抗生素具有殺滅或抑制細(xì)菌的作用, 被廣泛應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 常見的抗生素有磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類等[9]?？股赝ㄟ^抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成和控制細(xì)菌的代謝等途徑影響細(xì)菌的生長(zhǎng)[10], 因此, 抗生素的使用一定程度上緩解了細(xì)菌性疾病的暴發(fā)。由于在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用, 從而對(duì)環(huán)境造成了污染[11]。研究表明, 在用藥的過程中, 動(dòng)物通過生理代謝吸收了水環(huán)境中的部分抗生素, 而代謝率僅約為30%[12], 剩余的大部分抗生素及藥物殘留的代謝物重新被釋放到環(huán)境中, 對(duì)環(huán)境中生物的群落結(jié)構(gòu)造成很大破壞。特別是疾病發(fā)生過程中作為優(yōu)勢(shì)群體的病原菌, 在環(huán)境中殘留藥物的誘導(dǎo)作用下, 快速進(jìn)化并產(chǎn)生耐藥基因, 經(jīng)過持續(xù)的積累, 進(jìn)而形成多重耐藥細(xì)菌[13-14]。耐藥菌的產(chǎn)生以及其耐藥基因的突變給水產(chǎn)病害的治療增加難度, 在細(xì)菌防治中加大抗生素的劑量, 使得耐藥問題更加突出, 威脅人類和其他動(dòng)物的健康[15-16]。目前臨床使用的抗生素也被用在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)上, 當(dāng)來源于水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的耐藥菌對(duì)臨床所用的抗生素產(chǎn)生抗性之后, 其攜帶的耐藥基因一旦有機(jī)會(huì)進(jìn)入人體, 將會(huì)對(duì)人類造成極大的威脅[17-18]?？梢? 加大力度監(jiān)測(cè)水環(huán)境中細(xì)菌的動(dòng)態(tài)及耐藥狀況具有重要的意義和參考價(jià)值。而目前關(guān)于水生細(xì)菌耐藥性的研究主要集中在高密度養(yǎng)殖的魚類, 從網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類分離的細(xì)菌對(duì)阿莫西林、紅霉素、慶大霉素耐藥率均在20%以上[19]。針對(duì)開放海域中的雙殼貝類體內(nèi)外細(xì)菌的耐藥研究甚少, 而大部分的雙殼貝類具有濾食性特點(diǎn), 其與環(huán)境的關(guān)系最為密切, 也最能反應(yīng)水體環(huán)境狀況。因此本研究以廣東沿海地區(qū)的典型雙殼貝類——香港牡蠣為對(duì)象, 對(duì)其體內(nèi)異養(yǎng)菌進(jìn)行分離鑒定、分析, 研究牡蠣在高溫時(shí)期(6月份、9月份)中異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量、種類組成的變化以及對(duì)常用抗生素耐藥率的變化, 旨在為牡蠣細(xì)菌性疾病的預(yù)警及海洋微生態(tài)的環(huán)境健康研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與異養(yǎng)菌統(tǒng)計(jì)

2018年6月、9月在廣東沿海地區(qū)采取香港牡蠣(圖1)。 6月份采樣地點(diǎn): 汕頭(117°08′E, 23°46′N)、惠州(114°57′E, 22°71′N)、陽江(111°79′E, 21°68′N)、江門(112°57′E, 21°77′N)、臺(tái)山(112°78′E, 22°27′N)。9月份采樣的地點(diǎn)為臺(tái)山(112°78′E, 22°27′N)、汕尾(115°37′E, 22°78′N)、汕頭(117°08′E, 23°46′N)、湛江(109°75′E, 20°89′N)、陽江(111°79′E, 21°68′N)。采樣點(diǎn)溫度: 25.4℃~29.8℃。采樣點(diǎn)鹽度: 18.4~32.5。在每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)選取5~10只牡蠣, 用無菌生理鹽水清洗干凈后, 稱取0.5 g 的牡蠣消化道置于滅菌后的玻璃勻漿器中, 加入1 mL無菌生理鹽水混合后磨成勻漿, 以10–2、10–3的稀釋度進(jìn)行稀釋, 分別涂布于3種培養(yǎng)基Brain Heart Agar(BHA)培養(yǎng)基、Thio-sulfate Citrate Bile Salts(TCBS)培養(yǎng)基、Mueller-Hinton Agar(MHA)培養(yǎng)基(均購于環(huán)凱生物科技有限公司)。各個(gè)梯度均設(shè)置3個(gè)平行組, 涂布后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h, 然后對(duì)培養(yǎng)基的異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。BHA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果為異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù), TCBS培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果為弧菌數(shù), MHA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果用于計(jì)算單種藥物具有抗性的菌株比例見1.4。

圖1 廣東省采樣位點(diǎn)分布圖

1.2 耐藥菌株(單一藥物)的分離

通過添加單種藥物的培養(yǎng)基平板篩選培養(yǎng)耐藥菌株, 取1.1中勻漿液(10–2稀釋度)涂布于MHA培養(yǎng)基分別添加了慶大霉素、呋喃唑酮、利福平、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明7種藥物的MHA培養(yǎng)基, 涂布后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h, 然后進(jìn)行平板計(jì)數(shù), 并隨機(jī)挑取單菌落, 經(jīng)劃線分離純化后用甘油進(jìn)行保存(–80℃), 后續(xù)菌株鑒定見2.2和藥敏測(cè)試分析見2.3。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取及菌株的16S rDNA的PCR擴(kuò)增

DNA Maker、PCR-mix (含有 Taq DNA 聚合酶、d NTPs、緩沖液等 PCR 擴(kuò)增必需組分)、dd H2O均購于廣州東盛科技有限公司; 細(xì)菌DNA提取試劑盒(Mabio)購于廣州吉瑞生物科技有限公司; 引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。以質(zhì)檢合格的細(xì)菌DNA為模板, 進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件具體如下:

反應(yīng)體系(25 μL體系): PCR-mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 9.5 μL。引物8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為: 95℃ 5 min, 95℃ 40 s, 55℃ 40 s, 72℃ 45 s, 第2步到第四步進(jìn)行30個(gè)循環(huán), 72℃ 10 min, 4℃終止反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增獲得菌株的16S rDNA, 然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 得到單一條帶之后, 將樣品送由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序, 將測(cè)序結(jié)果輸入Gen Bank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中進(jìn)行比對(duì), 確定菌株的種類。

1.4 藥敏測(cè)試及耐藥率分析

所用藥敏紙片包括: 恩諾沙星(10 μg/片)、復(fù)方新諾明(25 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、呋喃唑酮(10 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、利福平(5 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、四環(huán)素(30 μg/片)、青霉素(10 U/片)、鏈霉素(10 μg/片)、紅霉素(15 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、阿莫西林(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、萬古霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、克林霉素(20μg/片)(均購于杭州生物試劑有限公司)。添加到培養(yǎng)基中的藥物粉劑分別是: 慶大霉素、呋喃唑酮、利福平、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明(7種藥粉均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

藥敏測(cè)試方法采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-bauer 擴(kuò)散法, 簡(jiǎn)稱 K-B法), 操作主要如下: 用斜面培養(yǎng)基活化菌株后在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 加入1 mL無菌生理鹽水, 渦旋震蕩后將斜面培養(yǎng)基上的菌苔洗脫下來, 混勻后吸100 μL菌液在MHA培養(yǎng)基上, 用涂布棒均勻涂開, 待菌液干后, 用滅菌的鑷子夾取藥敏紙片分別貼在培養(yǎng)基表面, 確保其與培養(yǎng)基充分接觸, 之后將其放在28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h, 用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈, 記錄抑菌圈的直徑, 根據(jù)NCCLS 的藥敏實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定(表1)細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感程度, 即敏感(S)、中度(I)、耐藥(R)。將判定為R的菌株標(biāo)記為耐藥菌株, 同時(shí)對(duì)3種及3種以上的抗生素存在抗性的判定為多重耐藥(Multiple-anti-biotics resistance, MAR)。

表1 20種抗生素的藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)單種藥物具有抗性的細(xì)菌與異養(yǎng)細(xì)菌的比率:

對(duì)單種藥物具有抗性的細(xì)菌比例=單種藥物平板

計(jì)數(shù)結(jié)果/未加抗生素平板計(jì)數(shù)結(jié)果×100%

耐藥菌株對(duì)多種藥物的耐藥率:

耐藥率(%)=耐藥菌株數(shù)量/受試菌株總數(shù)×100%

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel 2010 軟件整理, 各樣品之間的差異性分析采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同采樣地點(diǎn)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量

6月份的數(shù)據(jù)顯示, 廣東各沿海養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)由高到低依次為: 臺(tái)山(2.6×106~5.8× 106cfu/g)>江門(2.2×105~2.8×105cfu/g)>惠州(3.6× 104~7.8×104cfu/g)>汕頭(4.2×104~5.2×104cfu/g)>陽江(6.6×103~9.8×103cfu/g)。如圖2所示, 臺(tái)山地區(qū)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量高出其他地區(qū)1~3個(gè)數(shù)量級(jí)。各地牡蠣體內(nèi)弧菌數(shù)量由高到低依次為: 臺(tái)山(4.8×105~5.6× 105cfu/g)>江門(3.6×104~1.9×105cfu/g)>汕頭(2.2×104~ 3.2×104cfu/g)>惠州(6.8×103~1.8×104cfu/g)>陽江(8.0× 102~3.2×103cfu/g)。

圖2 6月份各采樣點(diǎn)的異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量

9月份廣東各沿海養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)由高到低依次為: 湛江(1.5×106~1.8×106cfu/g)>汕頭(5.8×105cfu/g)>陽江(2.2×105~2.4×105cfu/g)>汕尾(1.2×105~1.4×105cfu/g)>臺(tái)山(8×103~1.8×104cfu/g), 各地區(qū)之間異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異不顯著, 均在1個(gè)數(shù)量級(jí)之間(圖3)。各地牡蠣體內(nèi)弧菌數(shù)量由高到低依次為: 湛江(8.0×103~1.9×104cfu/g)>陽江(6.6×103~6.8× 103cfu/g)>臺(tái)山(6.6×103~6.8×103cfu/g)>汕頭(2.0×103~ 4.0×103cfu/g)>汕尾(6.9×102~7.1×102cfu/g)。

圖3 9月份各采樣點(diǎn)的異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌數(shù)量

據(jù)報(bào)道夏季養(yǎng)殖海水中營(yíng)養(yǎng)豐富, 細(xì)菌將會(huì)大量增殖[20]。本研究顯示, 在6月份與9月份汕頭、臺(tái)山及陽江的牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量均處于較高水平, 而不同地區(qū)存在不同程度的差異, 而同一地區(qū)不同月份也存較大的差異, 總體上, 6月份牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌比9月份異養(yǎng)細(xì)菌低1~2個(gè)數(shù)量級(jí), 如陽江地區(qū)6月份與9月份的異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異極顯著(<0.01), 相差1~2個(gè)數(shù)量級(jí)(圖4)。其中比較特別的, 臺(tái)山地區(qū)6月份異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量則比9月份異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量高1~2個(gè)數(shù)量級(jí), 異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量差異極顯著(<0.01)。其原因可能與臺(tái)山養(yǎng)殖區(qū)降水較少導(dǎo)致鹽度、溫度升高有關(guān), 已有報(bào)道異養(yǎng)細(xì)菌易受養(yǎng)殖環(huán)境(有機(jī)質(zhì)、鹽度、溫度、pH及水體營(yíng)養(yǎng)鹽)的影響[21]。

圖4 6月與9月異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量

2.2 牡蠣體內(nèi)耐藥細(xì)菌的分析

本次研究由沿海采樣點(diǎn)的香港牡蠣體內(nèi)共分離純化耐藥菌株310個(gè)。其中, 陽江地區(qū)分離耐藥菌株73個(gè)、臺(tái)山地區(qū)分離耐藥菌株64個(gè)、惠州地區(qū)分離耐藥菌株49個(gè)、汕尾地區(qū)分離耐藥菌株36個(gè)、汕頭地區(qū)分離耐藥菌株35個(gè)、湛江地區(qū)分離耐藥菌株30個(gè)、江門地區(qū)分離耐藥菌株23個(gè)。經(jīng)16S rDNA序列分析比對(duì)結(jié)果顯示, 此310個(gè)菌株分別屬于48種不同種屬, 主要為腸桿菌()、弧菌()、芽孢桿菌()、肺炎克雷伯菌()、希瓦氏菌()、不動(dòng)桿菌()、假單胞菌()、短波單胞菌()、發(fā)光桿菌()、鹽單胞菌()、黃桿菌()等。眾所周知, 弧菌是一種嗜鹽性細(xì)菌, 其廣泛分布于海洋中, 屬于條件致病菌, 當(dāng)外部鹽度條件發(fā)生改變或自身發(fā)生變異時(shí), 就會(huì)大量增殖[22]。據(jù)報(bào)道弧菌的數(shù)量達(dá)到一定閾值, 水產(chǎn)動(dòng)物將會(huì)被感染發(fā)病[23]。此外, 本次研究獲得菌株經(jīng)序列比對(duì), 分離得到的不動(dòng)桿菌屬主要為鮑曼不動(dòng)桿菌()。據(jù)報(bào)道, 近年來鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥問題越來越嚴(yán)重, 鮑曼不動(dòng)桿菌在環(huán)境中處于優(yōu)勢(shì)地位可能與耐藥特性有關(guān)[24]。而在復(fù)雜的水環(huán)境中, 高溫、高鹽天氣時(shí), 弧菌、希瓦氏菌、不動(dòng)桿菌等條件致病菌大量增殖, 對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物來說是潛在的風(fēng)險(xiǎn)[25-26], 尤其是包括牡蠣在內(nèi)的雙殼貝類, 發(fā)病前甚至發(fā)病初期都難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)癥狀, 因此, 在高溫季節(jié)時(shí)期, 定時(shí)監(jiān)測(cè)異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化, 有助于盡早發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖環(huán)境及養(yǎng)殖貝類的異常情況, 從而及時(shí)采取科學(xué)的防治措施, 有效預(yù)防和控制大規(guī)模細(xì)菌性疾病的暴發(fā)。

2.3 牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌的耐藥性

通過添加單種藥物的MHA培養(yǎng)基和未加抗生素的MHA培養(yǎng)基得到對(duì)單種藥物具有抗性的菌株比例, 由高到低為: 利福平(5.1%)>呋喃唑酮(4.2%)>慶大霉素(2.1%)>氯霉素(1.1%)>恩諾沙星(0.6%)>環(huán)丙沙星(0.3%)>復(fù)方新諾明(0.2%)。

另外, 對(duì)單種藥物平板篩選得到的 310個(gè)菌株進(jìn)行20種藥物的藥物敏感性實(shí)驗(yàn), 結(jié)果如圖5所示, 6月份篩選的菌株對(duì)呋喃唑酮耐藥率高達(dá)86%, 萬古霉素和克林霉素耐藥率達(dá)到78%以上, 而對(duì)其他抗生素均表現(xiàn)一定程度的耐藥性。9月份篩選的菌株對(duì)克林霉素、青霉素、呋喃唑酮耐藥率均在78%以上, 其中對(duì)克林霉素耐藥的菌株比例高達(dá)88%。除此之外, 所有受試菌株均對(duì)青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素表現(xiàn)抗性, 而對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星以及環(huán)丙沙星則較敏感。

圖5 菌株對(duì)20種抗生素的耐藥率

本研究中牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素普遍存在耐藥性, 對(duì)這六種抗生素的耐藥率均高于50%。其中6月份分離的菌株對(duì)呋喃唑酮和萬古霉素耐藥率明顯高于其他抗生素, 均在81%以上。9月份分離的菌株對(duì)克林霉素、青霉素耐藥率均在78%以上, 以往的研究表明青霉素的耐藥率也較高[27]。因?yàn)榍嗝顾?、克林霉素主要針?duì)革蘭氏陽性菌(G+), 其作用是抑制G+細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖合成, 而在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中主要是革蘭氏陰性菌(G–)。

多重耐藥性是指菌株同時(shí)對(duì)3種或3種以上抗生素存在抗性[15], 對(duì)牡蠣體內(nèi)分離的菌株進(jìn)行20種常見抗生素的敏感性試驗(yàn), 結(jié)果顯示, 6月份分離的多重耐藥菌株占84.18%。9月份分離的多重耐藥菌株占91.72%。其中6月份分離的菌株中有27.12%對(duì)10種以上抗生素表現(xiàn)出耐藥性。9月份分離的菌株中有47.36%對(duì)10種以上抗生素表現(xiàn)出耐藥性。

表2 牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌的多重耐藥率/%

自20世紀(jì)50年代多重耐藥細(xì)菌的發(fā)現(xiàn), 一直備受關(guān)注。在此前研究中從軍曹魚中分離的菌株多重耐藥菌株占9.8%[27], 而本研究中分離的多重耐藥菌株高達(dá)80%以上。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中分離多重耐藥細(xì)菌數(shù)量正逐年升高, 其耐藥性通過基因水平轉(zhuǎn)移方式不斷傳遞、擴(kuò)散, 威脅公共衛(wèi)生健康。本研究還發(fā)現(xiàn)一個(gè)重要結(jié)果, 即經(jīng)單種抗生素篩選分離得到的菌株對(duì)多種抗生素均表現(xiàn)出耐藥性, 具有較強(qiáng)的多重耐藥性。細(xì)菌主要通過膜的主動(dòng)外排系統(tǒng)使細(xì)胞內(nèi)泵中的抗生素排出和細(xì)胞膜的滲透性阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)膜的靶位來實(shí)現(xiàn)多重耐藥性[28]。另外, 高溫季節(jié)細(xì)菌大量增殖, 且水生動(dòng)物對(duì)抗生素的吸收與溫度呈正相關(guān)[29-30]。而水溫與水生細(xì)菌多重耐藥性的形成是否存在關(guān)聯(lián), 有必要進(jìn)一步深入研究。

2.4 水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的合理使用

由于養(yǎng)殖牡蠣的近海灣區(qū)富含各種浮游植物、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 因而是牡蠣生長(zhǎng)的理想?yún)^(qū)。但離人類生活區(qū)較近, 人類活動(dòng)殘留的抗生素沒有完全消除, 抗生素通過廢水排放和生物傳遞進(jìn)入水生環(huán)境[31]。另外, 部分養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中濫用抗生素, 導(dǎo)致抗生素殘留在水體中。這過程中殘留的抗生素對(duì)細(xì)菌起到篩選的作用, 使細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)和擴(kuò)散[32-33]。部分臨床醫(yī)學(xué)相關(guān)的致病菌如鮑曼不動(dòng)桿菌, 其耐藥性正不斷擴(kuò)散, 威脅人類和動(dòng)物的健康[34]。絕大多數(shù)抗生素對(duì)細(xì)菌性疾病或真菌性疾病有效, 但是, 不同的細(xì)菌性疾病, 致病機(jī)理有所不同, 故所用的抗生素也不同[35]。因此我們?cè)谒a(chǎn)養(yǎng)殖的過程中對(duì)抗生素的使用要嚴(yán)格按照規(guī)定, 從養(yǎng)殖的實(shí)際情況出發(fā)合理使用抗生素。同時(shí)應(yīng)該減少甚至禁止使用易于誘導(dǎo)細(xì)菌出現(xiàn)多重耐藥性的抗生素, 制定水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素使用規(guī)范條例及科學(xué)標(biāo)準(zhǔn), 建立有效的監(jiān)督機(jī)制。另一方面, 加強(qiáng)水生細(xì)菌的耐藥性的相關(guān)研究已刻不容緩, 尤其是多重耐藥性的形成機(jī)制以及耐藥傳播機(jī)理等方面。

3 結(jié)論

本文對(duì)廣東沿海地區(qū)6月、9月的香港牡蠣體內(nèi)異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)分析表明牡蠣體內(nèi)分離的異養(yǎng)細(xì)菌、弧菌多為嗜鹽性細(xì)菌, 其受溫度、鹽度影響較大?？傮w上, 9月份分離的異養(yǎng)細(xì)菌和弧菌比6月份高出1~2個(gè)數(shù)量級(jí)。310個(gè)菌株進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)80%的菌株的表現(xiàn)出多重耐藥性, 尤其對(duì)青霉素、卡拉霉素、呋喃唑酮、阿莫西林、克林霉素及萬古霉素的耐藥率都在50%以上。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中分離多重耐藥細(xì)菌數(shù)量正逐年升高, 病害防治中應(yīng)該對(duì)癥下藥, 減少甚至禁止使用易于誘導(dǎo)細(xì)菌出現(xiàn)多重耐藥性的抗生素。

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Investigation on the quantity and species of bacteria and their antibiotic resistance infrom the coast in Guangdong province

LI Bing1, 3, WANG Rui-xuan1, 2, XIE Yan-chun4, SHU Hu4, MOU Hong-li3, GUO Zi-han5, WANG Jiang-yong1, 3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306, China; 2. College of Food Technology and Life Science, Hanshan Normal University, Chaozhou, 521041, China; 3. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangdong Province; Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs South, Guangzhou 510300, China; 4. Guangzhou University, Guangzhou 510006, China; 5. California Baptist University, California 92504, USA)

Quantities of heterotrophic bacteria andspp. in oysters () from the coast of the Guangdong province during the high-temperature season (June and September) were analyzed. Antibiotic resistance of 310 bacterial strains isolated from medium containing different species with resistance to a single antibiotic, including gentamicin, furazolidone, rifampicin, ciprofloxacin, enrofloxacin, chloramphenicol, compound sulfamethoxazole, were further confirmed using the Kirby–Bauer method. Results showed that the 310 isolates belonged to 48 different species among the, andgenuses. The quantity of heterotrophic bacteria isolated from oysters in September was 1-2 orders of magnitude higher than that in June, with an exception of that in Taishan city. Heterotrophic bacteria quantities in oysters from the Taishan area peaked (2.6× 106to 5.8×106cfu/g) in June and were 1–3 orders of magnitude higher than those in other areas. Only 20 antibiotics were used for antibiotic susceptibility tests. Results showed that almost 310 strains were resistant to 20 antibiotics, with most strains resistant to penicillin, kanamycin, furazolidone, amoxicillin, clindamycin, and vancomycin. Multiple antibiotic resistance was widespread during the high-temperature period: 84.18% in June and 91.72% in September. Therefore, the present study provides an important reference for disease control in oyster farming and bacterial antibiotic resistance in aquaculture.

oysters; heterotrophic bacteria;; antibiotic resistance

Jul.14, 2019

S917.1

A

1000-3096(2020)03-0050-09

10.11759/hykx20191030001

2019-07-14;

2019-09-25

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-49); 廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(201620411); 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017A030313112)

[The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-49; Fund project of key laboratory of fishery environment of guangdong province, No.201620411; The Natural science foundation of Guangdong province, No. 2017A030313112]

(并列第1作者, 同等貢獻(xiàn)): 李炳(1995.10-), 男, 重慶璧山人, 碩士研究生, 主要從事細(xì)菌耐藥性研究 E-mail: 1029148315@ qq.com; 王瑞旋(1979.8-), 女, 廣東揭陽人, 副研究員, 博士, 主要從事水生生物病害防治 E-mail: wangruixuan@scsfri.ac.cn;通訊作者:王江勇, E-mail: wjy104@163.com

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)