劉 甜， 羅茜煜， 黃子杰， 鄭禎凱， 區(qū)芷褀， 馬立軍

(華南師范大學化學學院， 廣州 510006)

pH在化學反應、環(huán)境監(jiān)測以及生物系統(tǒng)等領域扮演著十分重要的角色[1-3]，pH的異常將引發(fā)一系列不良反應，如導致化學反應失敗、環(huán)境污染以及生物體病變等. 因此，在這些領域中對pH的準確測定具有非常重要的意義[4]. 傳統(tǒng)的pH檢測方法主要有指示劑法[5]、電位滴定法[6]、微電極法[7]、吸收光譜法以及電化學法等[8-9]，而熒光探針具有高選擇性、高靈敏度、高信噪比、操作簡單、響應快速、可連續(xù)監(jiān)控等優(yōu)點[10-11]，因此受到越來越多的關注.

迄今為止，許多優(yōu)異的pH熒光探針已被報道，其中一些探針已經(jīng)在分析化學、生理學和生物學中得到了廣泛應用. 然而，大部分探針只能檢測單一酸性[12-13]或堿性[14-15]范圍的pH，在實際應用中相對受限，只有很少一部分能夠在酸性和堿性2個范圍內(nèi)對pH進行檢測[16]. 因此，有必要設計能夠覆蓋較大pH范圍的熒光探針.

芘類化合物具有吸收系數(shù)大、單重態(tài)壽命長、熒光量子產(chǎn)率高、化學穩(wěn)定性好等優(yōu)良的光學性質，因此常被用作熒光團[17]. 目前已報道的少量基于芘的pH熒光探針[18-19]同樣存在檢測范圍有限的問題. 本文以芘甲醛作為熒光發(fā)色基團，與水合肼進行簡單的席夫堿反應，再與3,4-二羥基苯甲醛相結合，所得熒光探針分子4-((Z)-((E)-(芘-1-基亞甲基)亞肼基)甲基)苯-1,2-二醇(POH)上的亞氨基可以作為H+的識別基團，酚羥基作為OH-的識別基團，可同時檢測酸性和堿性溶液的pH.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器和試劑

儀器：熒光分光光度計(F-4600 FL，日本日立)、紫外-可見分光光譜儀(UV-2700,日本島津)、核磁共振波譜儀(NMR Systems 600 MHz,美國瓦里安)；液相色譜-質譜聯(lián)用儀(LCQ Deca XP MAX,美國賽默飛世爾)、pH計(PHS-3C,上海精密雷磁).

試劑：1-芘甲醛、3,4-二羥基苯甲醛、水合肼(體積分數(shù)為80%)、冰醋酸、無水乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、檸檬酸(CA)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、鹽酸等均為分析純，配制溶液用水為去離子水.

1.2 POH探針的合成與表征

POH探針的合成路線[20]如圖1所示,POH探針的合成主要分2步：芘亞甲基聯(lián)氨(1)的合成、POH(2)的合成.

圖1 POH的合成路線

將1-芘甲醛(0.234 5 g，1.00 mmol)溶于20 mL無水乙醇后加入水合肼(0.150 0 g，3.00 mmol)，滴加5滴冰醋酸作為催化劑，混合物在室溫下攪拌反應約4 h得黃色沉淀，然后用真空泵抽濾，濾餅經(jīng)過冰乙醇洗滌3次，最后將濾餅置于真空干燥箱中烘干得到0.182 1 g芘亞甲基聯(lián)氨(1)黃色粉末，產(chǎn)率74.5%.

稱取0.182 1 g產(chǎn)物1(0.745 mmol)溶于20.0 mL無水乙醇，加入3,4-二羥基苯甲醛(0.102 9 g，0.745 mmol)，再加5滴冰醋酸作為催化劑，混合物在室溫下攪拌反應約15 h得到橙黃色沉淀，采用真空泵抽濾，冰乙醇洗滌3次，最后置于真空干燥箱烘干得到0.206 0 g POH(2)橙黃色粉末，產(chǎn)率為75.9%.

化合物POH的1H NMR譜(600 MHz，DMSO)中化學位移分別為：δ9.70 (s,1H), 9.66 (s,1H), 9.38 (s,1H), 9.15 (d,J=9.3 Hz,1H),8.75～8.68 (m, 2H),8.42～8.35 (m,4H),8.32 (d,J=8.9 Hz,1H),8.26 (d,J=8.9 Hz,1H),8.15 (t,J=7.6 Hz,1H),7.46 (d,J=1.8 Hz,1H),7.24 (dd,J=8.1,1.8 Hz,1H),6.89 (d,J=8.0 Hz,1H). ESI-MS(甲醇作溶劑)：分子式為C24H16N2O2，相對分子質量理論值、實驗值分別為364.12、365.89.

1.3 測試溶液的配制

將POH溶于DMSO中配成濃度為5.0 mmol/L的母液，用CA、Na2HPO4、NaH2PO4分別與去離子水配制成不同pH的緩沖溶液(0.2 mol/L)，并用濃度均為1.0 mol/L的鹽酸和NaOH溶液對pH進行微調. 取12.0 μL POH母液加入到容積為3.0 mL的離心管中，配制成POH濃度為20.0 μmol/L的含DMSO(體積分數(shù)30%)且具有不同pH的緩沖溶液，進行后續(xù)的光譜測試.

2 結果與討論

2.1 探針POH對H+和OH-響應的紫外-可見吸收光譜

為了更直觀地觀察探針對pH的響應現(xiàn)象，對酸性和堿性2個pH范圍內(nèi)的溶液紫外-可見吸收光譜分別作圖(圖2). 由于N原子的質子化，POH的譜圖在pH小于6.00時出現(xiàn)2個吸收峰(圖2A)，波長分別為285、310 nm，歸因于芘環(huán)內(nèi)部的π-π*躍遷. 當pH從2.00增加到6.43時，在波長為285、310 nm處的吸收峰強度不斷減弱; 當pH為6.43時，由于N原子的質子化作用減弱，孤對電子得到釋放導致芘環(huán)內(nèi)部的π-π*逐漸消失，n-π*躍遷慢慢增強，在波長約400 nm處開始出現(xiàn)1個新的吸收峰. 當pH持續(xù)增加時，該處的吸收峰強度增大且伴隨著紅移現(xiàn)象，導致溶液的顏色由無色變?yōu)闇\黃色. 在pH由7.00增加到11.12的過程中(圖2B)，紫外吸收峰持續(xù)紅移，與此同時溶液的顏色由淺黃色變?yōu)槌赛S色. 產(chǎn)生這些變化的原因可能是堿性條件下POH分子上的酚羥基發(fā)生去質子化作用，導致推電子能力增強，電子流動性變大使得苯環(huán)上電子云密度發(fā)生改變，增強了從苯環(huán)到N原子上的分子內(nèi)電荷轉移(ICT)作用，從而導致吸收光譜發(fā)生明顯紅移，并且伴隨溶液顏色的改變.

圖2 不同pH下POH的紫外-可見吸收光譜和顏色變化

Figure 2 The UV-Vis spectra and color transformation of POH at different pH

2.2 探針POH對H+和OH-響應的熒光識別

在酸性條件下，測試激發(fā)波長為350 nm時的熒光發(fā)射光譜(圖3A)，POH的緩沖溶液在波長465 nm處有較強的熒光發(fā)射峰，且在紫外燈照射下溶液呈現(xiàn)藍色熒光. 隨著pH的不斷增大，POH的熒光強度逐漸減弱，在pH=7.00時熒光強度幾近猝滅. 產(chǎn)生這種變化的原因是酸性條件下由于N原子的質子化作用，抑制了POH分子內(nèi)N原子對芘環(huán)的光致電子轉移(PET)效應，從而使酸性條件下芘環(huán)的熒光得以恢復; 中性條件下N原子未被質子化，因此自由電子轉入激發(fā)態(tài)熒光團，使熒光猝滅. 當pH繼續(xù)增至9.00時(圖3B)，POH緩沖溶液在波長465 nm處熒光峰的強度又開始逐漸增強，紫外燈下溶液的熒光變?yōu)榱了{色. 這種變化歸因于堿性條件下POH分子中苯環(huán)上的酚羥基發(fā)生去質子化作用，推電子能力增強，電子流動性變大使苯環(huán)上電子云密度發(fā)生改變從而增強了從苯環(huán)到N原子上的ICT作用，同時阻止了N原子對芘環(huán)的PET作用而使熒光強度開始增加(圖4).

圖3 不同pH下POH的熒光光譜

圖4 POH探針的酸堿響應過程

根據(jù)方程[21]

pKa=pH+lg[(Fmax-F)/(F-Fmin)]

可以計算出2個范圍內(nèi)POH的pKa，pH在1.85～7.62酸性范圍時pKa=4.69(圖5A)，pH在7.51～11.12堿性范圍內(nèi)POH的pKa=10.40(圖5B)，說明POH在酸性和堿性2種條件下都能很好地檢測溶液的pH[22]，是一種檢測范圍很寬且靈敏度高的pH熒光探針.

圖5 POH的熒光發(fā)射峰強度與pH的關系

Figure 5 The intensity of the fluorescence emission peak of POH at different pH

2.3 探針POH的抗干擾性

為了研究探針POH的實用性，對其進行干擾性實驗檢測. 在pH為2.34和10.21的POH緩沖溶液中分別加入10倍濃度的常見金屬離子，并測試其熒光發(fā)射光譜(圖6). 在酸性溶液中，金屬離子的加入對POH溶液的熒光峰強度影響不大(圖6A)；而在堿性溶液中，除了Hg2+、Mn2+和Co2+等少數(shù)金屬離子干擾較大外，其余金屬離子對pH的檢測幾乎無影響. 總體上，POH是一種具有實際應用潛力的高選擇性pH熒光探針.

圖6 不同pH下POH溶液的抗干擾性檢測

3 結論

采用芘甲醛與3，4-二羥基苯甲醛通過與水合肼之間的席夫堿反應合成了一種高靈敏性、高選擇性的pH熒光探針POH，并表征了它的結構. 通過對紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測試，發(fā)現(xiàn)探針POH在酸性和堿性條件下對緩沖溶液的pH均表現(xiàn)出比色和熒光的雙重識別響應，并且溶液顏色有明顯的轉變. 同時在不同pH下與其他常見金屬離子共存時對pH檢測的干擾影響不大，是一種可以檢測很寬范圍pH的高潛力應用型熒光探針.