蔣素華 梁芳 牛蘇燕 張燕 馬杰 袁秀云 崔波

摘? 要：為探究蘭科植物的花香基因，拓展蘭科植物在花香分子育種方面思路。以萼脊蘭花瓣為實(shí)驗(yàn)材料，按照NCBI上登錄的蘭科植物的HMGR基因序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆萼脊蘭3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（SjHMGR）。采用生物信息學(xué)方法，利用內(nèi)參基因EF1a，對(duì)SjHMGR基因的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行分析研究。結(jié)果顯示，獲得的SjHMGR基因全長(zhǎng)為1892 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?689 bp，編碼367個(gè)氨基酸，登錄號(hào)為MK448292;SjHMGR有3個(gè)HMG-COA特殊位點(diǎn)，且屬于HMG-COA超基因家族;SjHMGR編碼的蛋白為親水性蛋白;亞細(xì)胞定位于線粒體;蛋白質(zhì)2級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR蛋白具有α-螺旋、延伸鏈和不規(guī)則折疊。SjHMGR編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SjHMGR在中間代謝起到非常重要的角色;同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，萼脊蘭SjHMGR蛋白與蘭科的進(jìn)化距離最近，在同1個(gè)分支上。qRT-PCR結(jié)果顯示，SjHMGR基因在根和葉中的表達(dá)量很低，在萼片和花瓣中的表達(dá)較高，具有時(shí)空特異性。

關(guān)鍵詞：萼脊蘭;SjHMGR基因;克隆;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S682.31? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Bioinformatics Analysis of SjHMGR Gene in Sedirea

Japonica

JIANG Suhua， LIANG Fang， Niu Suyan， ZHANG Yan， MA jie， YUAN Xiuyun， CUI Bo*

Institute of Bioengineering， Zhengzhou Normal University， Zhengzhou， Henan 450044， China

Abstract： In order to explore the floral fragrance genes and develop ideas for molecular breeding of floral fragrance of orchid plants， the petals of Sedirea japonica were used as the experimental materials， and primers were designed according to the HMGR gene sequence of orchid plants registered in NCBI. The 3-hydroxy-3-methyl-glutaric coenzyme A reductase gene （SjHMGR） was cloned successfully by RT-PCR and RACE. The bioinformatics of SjHMGR gene was analyzed. The spatiotemporal expression characteristics of SjHMGR gene were analyzed using the internal reference gene EF1a. The results showed that the length of SjHMGR gene was 1892 bp， the open reading frame was 1689 bp， encoding 367 amino acids， and the login number was MK448292. SjHMGR had three special loci of HMG-COA and belonged to the HMG-COA supergene family. The SjHMGR was a hydrophilic protein in mitochondria. Alpha helix elongated chain and irregular folding were found in the secondary structure. Functional prediction of SjHMGR-encoded proteins revealed that SjHMGR played an important role in intermediate metabolism. Homology analysis and phylogenetic tree analysis showed that the homology of SjHMGR protein was the closest to the evolution of Orchidaceae and on the same branch. The results of qRT-PCR showed that the expression of SjHMGR gene in roots and leaves were very low， and that in sepals and petals was high， which had spatial and temporal specificity.

Keywords： Sedirea japonica; SjHMGR; clone; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.014

萼脊蘭（Sedirea Japonica）是蘭科萼脊蘭屬植物，花朵小，花的顏色優(yōu)雅素凈，有香氣，開(kāi)花時(shí)間4—6月，易栽培且抗性較強(qiáng)[1-2]。萼脊蘭由于其特殊的生長(zhǎng)環(huán)境及香氣迷人，成為現(xiàn)在人們追捧的對(duì)象，具有巨大的市場(chǎng)空間。蘭科是最大的單子葉植物科之一，有25 000多種，蘭花的香味更是人們喜歡的一大特點(diǎn)。張瑩等[3-4]分析了文心蘭的香氣成分;李崇暉等[5]對(duì)4種石斛原生種鮮花的香氣組成成分進(jìn)行了分析;丁靈等[6]測(cè)定了7種秋石斛鮮花香氣中的揮發(fā)性成分;呂素華等[7]分析了11個(gè)鐵皮石斛雜交家系鮮花的揮發(fā)性物質(zhì);Hsiao等[8]研究了蝴蝶蘭單萜類生物合成途徑;Huang等[9]研究了蕙蘭香氣物質(zhì)MeJA的釋放規(guī)律。以上研究認(rèn)為，萜烯類、酯類、醇類和醛類對(duì)石斛的花香起著重要作用。從美洲熱帶、非洲熱帶、澳大利亞熱帶和歐洲部分地區(qū)的蘭科花卉中發(fā)現(xiàn)了許多揮發(fā)性成分。但人們對(duì)蘭花花香的生物合成途徑還不是很了解。對(duì)于控制單子葉植物（蘭花）氣味產(chǎn)生的酶和基因知之甚少，且如果沒(méi)有基因組學(xué)，理解其中的分子機(jī)制可能是無(wú)法克服的問(wèn)題。有文獻(xiàn)記載，已有1700多種揮發(fā)性物質(zhì)從90多種植物中鑒別，主要是萜類、苯丙類化合物、脂肪酸或者氨基酸衍生物[10]。

植物的氣味因揮發(fā)性化合物的數(shù)量、特性和相對(duì)量的不同而不同，花香也是在植物與昆蟲(chóng)、植物與植物、植物與非生物脅迫的相互作用中一個(gè)關(guān)鍵的因素，并且在傳粉、果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育和植物防御方面起到一個(gè)關(guān)鍵的作用[11]。在植物花香有關(guān)的酶基因研究進(jìn)展下面，Dudareva等[11]從仙女扇（Clarkia breweri）中克隆出編碼（S）-芳樟酶醇合成酶基因的全長(zhǎng)cDNA，之后花香物質(zhì)等形成的相關(guān)基因如PAAS、BSMT、BEBT、SAMT、BEAT和IEMT等相繼被克隆出來(lái)。植物花香物質(zhì)的合成與萜類化合物代謝有關(guān)，根據(jù)萜類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的異戊二烯數(shù)目可把萜類物質(zhì)分為不同種類[11]?？茖W(xué)家們不斷探索發(fā)現(xiàn)了植物萜類化合物的合成主要是由甲醛戊酸途徑（MVP）和脫氧木酮糖-5-磷酸（DXP）途徑共同合成[12]。在這2個(gè)途徑中，最主要的中間產(chǎn)物異戊二烯焦磷酸（IPP）、單萜、倍半萜、二萜、三萜等均是由它產(chǎn)生的化合物[13]。甲醛戊酸（MVA）途徑中的限速酶是還原酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR），這個(gè)限速酶可催化3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A （HMG-CoA）生成甲羥戊酸[14]。關(guān)于HMGR在多種植物中均有深入研究，如從馬鈴薯[15、橡膠草[16]、刺五加[17]、甜瓜[18]、藿山石斛[19]等多種植物中的HMGR被克隆出來(lái)。在蹄葉橐吳萜類化合物-紫苑酮的研究中發(fā)現(xiàn)，將N端缺少的HMGR基因在薰衣草中通過(guò)轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)，其促進(jìn)薰衣草精油和植物甾醇的產(chǎn)生[20]。將長(zhǎng)春花的HMGR基因轉(zhuǎn)到青蒿中，可使青蒿中青蒿素的含量變多，在煙草中過(guò)表達(dá)陽(yáng)春砂的HMGR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萜類、植醇及甾醇的表達(dá)量都明顯增多[21]。大量研究證明，甲醛戊酸途徑的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)是HMGR，但目前關(guān)于HMGR在萼脊蘭花香中的作用研究較少，所以本研究從SjHMGR的全長(zhǎng)cDNA開(kāi)始，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和時(shí)空表達(dá)分析，研究該基因在萼脊蘭花香物質(zhì)合成中的關(guān)鍵作用，為后續(xù)萼脊蘭SjHMGR基因的功能驗(yàn)證和蘭花新品種培育打下良好的基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于鄭州師范學(xué)院的蘭花工程技術(shù)研究中心。盛花期取萼脊蘭花瓣進(jìn)行基因片段克隆，并取其苗期根和葉，花蕾期根、葉和花蕾，盛花期的根、葉、花葶、萼片、花瓣、合蕊柱，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、rTaq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RACE擴(kuò)增試劑盒、質(zhì)粒小提和實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司。引物的合成和基因測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.2? 方法

RNA的提?。翰捎枚嗵嵌喾又参锟俁NA提取試劑盒對(duì)萼脊蘭花瓣進(jìn)行RNA的提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，采用微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定RNA的OD260/280及濃度。

HMGR基因保守片段的克?。阂蕴崛〉妮嗉固m花瓣總RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA。根據(jù)XP_020579399（蝴蝶蘭）、AGT78194 （霍山石斛）、XP_020705018（鐵皮石斛）物種的HMGR基因保守區(qū)，綜合利用DNA AN 6.0和Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增SjHMGR保守片段。最后將擴(kuò)增出來(lái)的基因片段進(jìn)行電泳檢測(cè)和菌液測(cè)序。

SjHMGR全長(zhǎng)基因克隆及ORF驗(yàn)證：以萼脊蘭的花瓣cDNA 為PCR擴(kuò)增模板，利用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增SjHMGR的5端和3端序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，電泳檢測(cè)及菌液測(cè)序。將測(cè)序正確的HGMR基因保守片段、5端和3端序列利用DNAMAN軟件拼接得到HGMR基因序列全長(zhǎng)，根據(jù)獲得的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)1對(duì)引物 HMGR-F2和 HMGR-R2，進(jìn)行ORF擴(kuò)增，用于HGMR基因全長(zhǎng)序列驗(yàn)證（引物見(jiàn)表1）。

1.3? 生物信息學(xué)分析

開(kāi)放閱讀框的預(yù)測(cè)采用ORFfinder;基因相似性分析采NCBI上的BLAST;氨基酸序列比對(duì)分析采DNAMAN;蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析采用ProtParam;蛋白質(zhì)親疏水性采用ProtScale程序分析;亞細(xì)胞定位分析采用用TargetP軟件和PSO RTⅡ;SjHMGR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和功能分析預(yù)測(cè)采用ProtFun。蛋白質(zhì)2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用ExPASy網(wǎng)站上的GOR;蛋白質(zhì)3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SWISS- MODEL進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。

1.4? SjHMGR基因的時(shí)空表達(dá)分析

根據(jù)SjHMGR基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性較強(qiáng)的qRT-PCR引物，參照SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ使用說(shuō)明，利用qRT-PCR的方法檢測(cè)SjHMGR基因在萼脊蘭不同發(fā)育階段及不同器官的表達(dá)量。EF1a作為內(nèi)參基因，計(jì)算該基因的相對(duì)表達(dá)量。目的基因SjHMGR和內(nèi)參基因EF1a的退火溫度均為58 ℃，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，蒸餾水做為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系共為20 L，反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共41個(gè)循環(huán)，PCR結(jié)果按照相對(duì)表達(dá)量Rel. Exp=2ΔΔCT計(jì)算，式中ΔCT=CT （HMGR）?CT （EF1a RNA），ΔΔ CT=（各植物組織ΔCT）?（萼片ΔCT） [20-21]。qRT-PCR引物及參數(shù)見(jiàn)表2。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 萼脊蘭總RNA的提取

由圖1可知提取的花瓣總RNA具有完整的28 S、18 S和5 S條帶，說(shuō)明提取的總RNA完整性好，很少降解。OD260/280的值為1.99，濃度為98.7 ng/μL。

2.2? SjHMGR基因克隆和蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

以花瓣總cDNA為模板，對(duì)保守區(qū)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1個(gè)1358 bp基因片段（圖2A），利用RACE擴(kuò)增技術(shù)，根據(jù)設(shè)計(jì)的3′端和5′端特異性引物，擴(kuò)增出5′端（圖2B）和3′端（圖2C）的目的片段。DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接得該基因的全長(zhǎng)為1892 bp，ORFfinder分析發(fā)現(xiàn)，該基因序列共有7個(gè)ORF，最長(zhǎng)的ORF為1689 bp，包含115 bp的5′-UTR、88 bp的3′-UTR。利用全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出ORF片段1716 bp，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pGEM-HMGR，說(shuō)明全長(zhǎng)Sj HMGR基因序列拼接正確。理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為60.06 kDa，等電點(diǎn)為7.43;氨基酸結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR有3個(gè)HMG-COA特殊位點(diǎn)，且屬于HMG-COA超基因家族。

2.3? SjHMGR蛋白質(zhì)的親疏水性分析

蛋白質(zhì)的親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，SjHMGR蛋白質(zhì)序列具有較強(qiáng)的疏水性，其中第88位的親水性最強(qiáng)（2.767），第552位的疏水性最強(qiáng)（2.567），整體來(lái)看，親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，并且多于疏水性的氨基酸。因此，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性，可認(rèn)為該酶是親水性蛋白。

2.4? SjHMGR編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)與分析

分析預(yù)測(cè)SjHMGR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能及功能分類發(fā)現(xiàn)，可能有意義的功能主要有作為細(xì)胞被膜、脂肪酸代謝、翻譯功能、中間代謝、合成輔酶因子等，其幾率分別是11.180、5.831、4.361、4.224、4.143。這表明SjHMGR在中間代謝中起到了一個(gè)很重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯過(guò)程中起到較為重要的作用，在輔酶因子的生物合成中也起到了關(guān)鍵性作用。

2.5? SjHMGR編碼蛋白質(zhì)的2級(jí)、3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，α-螺旋所占比率為27.05%，延伸鏈所占比率為24.02%，不規(guī)則折疊所占比率為48.93%（圖3）。以1dq9.1.C為模板進(jìn)行蛋白3級(jí)結(jié)構(gòu)建模，該蛋白質(zhì)以X-RAY 2.80 ?的方法產(chǎn)生，覆蓋率為74%，模板與SjHMGR蛋白一致性為57.31%（圖4）。

2.6? 氨基酸序列同源性分析

通過(guò)BlastP對(duì)HGMR蛋白進(jìn)行序列同源比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其蛋白在氨基酸水平上與蘭科植物的HG MR蛋白具高度同源性，其中與蝴蝶蘭（XP_020 57 9399）蛋白的同源性最高（96%），與霍山石斛（AG T78194）的蛋白同源性為87%，與鼓槌石斛（AHI 88624）的蛋白同源性為87%（圖5）。進(jìn)一步利用MEGA 6.0軟件，采用相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，

根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示，萼脊蘭SjHMGR蛋白與蝴蝶蘭（P. Sequestris XP_020 579399）、與霍山石斛（D. huoshanense AGT 78 1 9 4）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum AHI88624）、鐵皮石斛（D. officinale XP 020705018）的HMGR蛋白處于同1個(gè)分支上，其中與蝴蝶蘭的親緣關(guān)系最近（圖6）。

2.7? 萼脊蘭SjHMGR基因的時(shí)空表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGR基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性。在萼脊蘭的營(yíng)養(yǎng)器官中，葉片、根中SjHMGR基因表達(dá)量很低，幾乎為

零（圖7）;在花蕾期，花蕾中表達(dá)量也接近與零;盛花期，SjHMGR基因的表達(dá)具有明顯組織特異性，花葶和合蕊柱中幾乎不表達(dá)，萼片、花瓣中表達(dá)量較高，萼片的表達(dá)量高于花瓣的表達(dá)量，花葶和合蕊柱中的表達(dá)幾乎為零（圖8）?？傊?，SjHMGR

基因主要在萼片中表達(dá)，花瓣中的表達(dá)量低于萼片的表達(dá)量，同時(shí)也說(shuō)明SjHMGR基因在盛花期才表達(dá)，處于苗期和花蕾期的SjHMGR基因是幾乎不表達(dá)的。

3? 結(jié)論

萼脊蘭屬于蘭科中較適宜觀賞的一種附生蘭，因其花具有濃郁花香，深受人們喜愛(ài)。與氣味相關(guān)的萜類合成基因GPPS、DXR、DXS、TPS研究較多，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）作為萜類成分甲羥戊酸（MVA）合成途徑上第1個(gè)重要限速酶，對(duì)植物萜類活性成分生物合成過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，所以研究HMGR基因的功能與生理學(xué)特性具有深遠(yuǎn)的意義[22]。大量研究表明：倍半萜類物質(zhì)的合成與HMGR活性呈正相關(guān)，提高植物體內(nèi)HMGR基因的表達(dá)水平可顯著提高倍半萜類物質(zhì)的含量[23]。研究發(fā)現(xiàn)，倍半萜類化合物生物的合成主要通過(guò)甲羥戊酸（MVA）途徑，HMGR是MVA合成途徑中的關(guān)鍵基因，對(duì)甲羥戊酸代謝“碳流”的調(diào)控起到重要的作用，如果改變HMGR活性可會(huì)有效調(diào)控萜類化合物的含量[24]。

試驗(yàn)成功克隆萼脊蘭SjHMGR基因，全長(zhǎng)1892 bp，開(kāi)放閱讀框1689 bp，編碼367個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為60.06 kDa，等電點(diǎn)為7.43;SjHMGR編碼的蛋白為親水性蛋白;SjHMGR有3個(gè)HMG-COA特殊位點(diǎn)，且屬于HMG-COA超基因家族;蛋白質(zhì)2級(jí)結(jié)構(gòu)分析α-螺旋占27.05%，延伸鏈占25.02%，不規(guī)則折疊占48.93%。

已有研究表明，SjHMGR 基因在不同植物組織的表達(dá)模式表現(xiàn)出較大的差異性，在人參的花中表達(dá)量最高，莖中的表達(dá)量最低[24];在露水草的根和葉中的表達(dá)豐富[25]。萼脊蘭SjHMGR基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)器官根和葉中的表達(dá)量很低，生殖器官萼片和花瓣的表達(dá)量較高，花蕾和花葶中沒(méi)有表達(dá)，結(jié)果顯示SjHMGR基因只有在盛花期才有表達(dá)，花蕾期的表達(dá)幾乎為零，與丁靈等[6]研究的蝴蝶石斛蘭‘日出2號(hào)主要發(fā)香部位是萼片，合蕊柱基本不發(fā)香的研究結(jié)果一致，但研究中也指出不同品種的石斛蘭花朵花瓣基本均是主要發(fā)香部位，說(shuō)明不同品種蘭花的發(fā)香部位不一樣。為進(jìn)一步研究萼脊蘭的發(fā)香部位提供了新的思路。本研究結(jié)果還顯示，SjHMGR在中間代謝中起到了一個(gè)很重要的角色，在脂肪酸代謝、翻譯過(guò)程中起到較為重要作用，在輔酶因子的生物合成中也起到了關(guān)鍵作用，相信該研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)均為萼脊蘭SjHMGR基因的功能驗(yàn)證和新品種的培育打下良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

陳心啟， 吉占和. 中國(guó)蘭花全書(shū)[M]. 北京： 中國(guó)林業(yè)出版社， 1998.

王卜瓊， 李枝林， 余朝秀. 蘭花育種研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2005， 32（3）： 551-556.

張? 瑩， 李辛雷， 王? 雁， 等. 文心蘭不同花期及花朵不同部位香氣成分的變化[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44（1）： 110-117.

張? 瑩， 田? 敏， 王彩霞， 等. 不同溫度條件下香水文心蘭花香氣的成分分析及感官評(píng)定[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2015， 24（2）： 112-114.

李崇暉， 黃明忠， 黃少華， 等. 4種石斛屬植物花朵揮發(fā)性成分分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 2015， 23（4）： 454- 462.

丁? 靈， 李崇暉， 尹俊梅. 七種秋石斛鮮花揮發(fā)性成分差異性分析[J]. 廣西植物， 2016， 36（3）： 361-368， 288.

呂素華， 徐? 萌， 張新鳳， 等. 11個(gè)鐵皮石斛雜交家系鮮花的揮發(fā)性成分分析[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2016， 22（6）： 52-57.

Hsiao Y Y， Tsai W C， Kuoh C S， et al. Comparison of transcripts in Phalaenopsis bellina and Phalaenopsis equestris （Orchidaceae） flowers to deduce monoterpene biosynthesis pathway[J]. BMC Plant Biology， 2006， 6（1）： 14-14.

Huang M， Ma C， Yu R， et al. Concurrent changes in methyl jasmonate emission and the expression of its biosynthesis-related genes in Cymbidium ensifolium flowers[J]. Physiologia Plantarum， 2015， 153（4）： 503-512.

Dobson H E M， Bergstrom G， Groth I. Differences in fragrance chemistry between flower parts of Rosa rugosa Thunb. （Rosaceae）[J]. Israel Journal of Botany， 1990， 39（1-2）： 143-156.

Dudareva N， Pichersky E. Biochemical and molecular genetic aspects of floral scents[J]. Plant Physiology， 2000， 122（3）： 627-633.

Cao X Y， Li C G， Miao Q， et al. Molecular cloning and expression analysis of a leaf-specific expressing 3-hydroxy-3- methylglutaryl-CoA （HMG-CoA） reductase gene from Michelia chapensis Dandy[J]. Journal of Medicinal Plant Research， 2011， 5（16）： 3868-3875.

Dai Z， Cui G， Zhou S F， et al. Cloning and characterization of a novel 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene from Salvia miltiorrhiza involved in diterpenoid tanshinone accumulation[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（2）： 148-157.

Doblas V G， Amorim-Silva V， Posé D， et al. The SUD1 gene encodes a putative E3 ubiquitin ligase and is a positive regulator of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2013， 25（2）： 728-743.

陳大華， 葉和春， 李國(guó)鳳， 等. 馬鈴薯HMGR基因的克隆序列分析及其表達(dá)特征[J]. 植物學(xué)報(bào)， 2000， 42（7）： 724-727.

王啟超， 劉實(shí)忠， ?，F(xiàn)周. 橡膠草HMGR基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 植物研究， 2012， 32（1）： 61-68.

李遠(yuǎn)華， 陸建良， 范方媛， 等. 茶樹(shù)根系HMGR基因克隆及其表達(dá)分析[J]. 茶葉科學(xué)， 2014， 34（6）： 583-590.

郝金鳳， 李彤彤， 郭艷瓊， 等. 甜瓜HMGR基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及序列分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2010（8）： 106-109， 115.

林榕燕， 賴鐘雄. 霍山石斛HMGR基因的克隆及其定量表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（10）： 1975- 1983.

杜? 鵑. 蹄葉橐吾萜類化合物合成相關(guān)基因克隆及功能研究[D]. 長(zhǎng)春： 吉林大學(xué)， 2007.

劉? 卉. 陽(yáng)春砂HMGR 和DXR 基因在煙草萜類化合物生物合成中的功能研究[D]. 廣州： 廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 2012.

黃昕蕾. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的鼓槌石斛花色花香形成分子調(diào)控機(jī)理研究[D]. 北京： 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院， 2018.

Zeidabadi D D， Javaran M J， Dehghani H， et al. An investigation of the HMGR gene and IPI gene expression in black caraway （Bunium persicum）[J]. 3 Biotech， 2018， 8（9）： 405.

羅紅梅， 宋經(jīng)元， 李雪瑩， 等. 人參皂苷合成生物學(xué)關(guān)鍵元件HMGR 基因克隆與表達(dá)分析[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 48（2）： 219-227.

王秋軍. 露水草HMGR基因的克隆分析及20-羥基蛻皮甾酮生物合成調(diào)控研究[D]. 蘇州： 蘇州大學(xué)， 2014.