吳麗芳 魏曉梅 張麗芳 桂寶林

摘? 要：以云南2種野生苜蓿資源為材料，采用水培法研究酸鋁脅迫對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響。通過(guò)分析酸、鋁單一及復(fù)合處理下幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量、根系活力、葉綠素和丙二醛含量、過(guò)氧化物酶和超氧化物岐化酶活性變化，比較2種苜蓿對(duì)酸、鋁的耐性。結(jié)果顯示：隨著酸度的增加，天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿幼苗的生長(zhǎng)均受抑制，pH 7.0和pH 3.0處理對(duì)比分析，天藍(lán)苜蓿在根長(zhǎng)、株高、生物量、根系活力增幅比紫花苜蓿的增幅小;鋁脅迫后，2種苜蓿在根長(zhǎng)、株高、生物量、根系活力指標(biāo)上均具有顯著差異，且隨著鋁濃度的增大，受抑制越嚴(yán)重;酸、鋁共同脅迫對(duì)2種苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響大于單一脅迫對(duì)它的影響，pH 4.5，Al3+濃度300 mg/L時(shí)，2種苜蓿生長(zhǎng)受抑最嚴(yán)重。酸、鋁單一脅迫及復(fù)合處理均顯著影響2種苜蓿，但天藍(lán)苜蓿對(duì)酸、鋁及酸鋁的耐性優(yōu)于紫花苜蓿。

關(guān)鍵詞：苜蓿;酸鋁脅迫;幼苗生長(zhǎng);抗氧化酶系

中圖分類號(hào)：S551+.7? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis on Acid-aluminum Stress Response of Two Wild Alfalfa Resources in Yunnan

WU Lifang1， WEI Xiaomei1， ZHANG Lifang1， GUI Baolin2

1. College of Biological Resource and Food Engineering / Center for Yunnan Plateau Biological Resources Protection and Utilization， Qujing Normal University， Qujing， Yunnan 655011， China; 2. Soil Fertilizer Workstation， Xundian County Agricultural Bureau， Xundian， Yunnan 650224， China

Abstract： Two wild alfalfa resources （Medicago lupulina， Medicago sativa） in Yunnan were used to study the effects of acid-aluminum stress on alfalfa seedling growth under water culture. The tolerance of the two alfalfa to acid and aluminum was compared by analyzing the changes of peroxidase and superoxide dismutase activities， root length， plant height， biomass， root vigor， chlorophyll content， malondialdehyde content under single and compound treatment of acid and aluminum. The seedling growth of the two alfalfas was inhibited significantly under acidity treatment. Comparation with pH 7.0 and pH 3.0， the root length， plant height， biomass and root activity of M. lupulina increased less than that of M. sativa. There were significant differences in the indexes for root length， plant height， biomass， root vigor between the two alfalfa resources under aluminum treatment. Seedling growth was seriously reduced with the increase of aluminum concentration. The influences of acidity and aluminum compound treatment on the seedling growth of the two alfalfa were greater than those of either stress in isolation. The growth of the two alfalfa was most severely inhibited under the pH 4.5， Al3+ 300 mg/L treatment. Under the conditions of acid， aluminum or acid-aluminum stress treatments， the tolerance of M. lupulina to acid， aluminum and acid-aluminum was better than that of M. sativa from the point of view of the indexes of growth or decline of seedling growth， physiological indicators， inhibition rate.

Keywords： alfalfa; acid-aluminum stress; seedling growth; antioxidant enzyme system

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.009

我國(guó)酸性土壤主要分布于南方15省、市、自治區(qū)，總面積約占全國(guó)土地面積的21%[1]，且隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的加快，農(nóng)業(yè)上化學(xué)肥料的使用，酸性土壤面積日愈擴(kuò)大，因此土壤酸化及酸性土壤對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響早已成為一個(gè)研究焦點(diǎn)問(wèn)題。鋁毒是酸性土壤上限制植物生長(zhǎng)重要元素，常以不同的形式存在，其中離子態(tài)[Al3+、Al（OH）2+、Al（OH）2+]對(duì)植物的毒害最為嚴(yán)重。酸性土壤上鋁毒對(duì)植物的傷害首先表現(xiàn)于根部，其會(huì)破壞根尖結(jié)構(gòu)，抑制根系生長(zhǎng)[2-3]，進(jìn)而影響植株地上部分生長(zhǎng)，最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)。

苜蓿（Medicago sativa）是發(fā)展畜牧業(yè)不可或缺的豆科牧草之一，在我國(guó)已有上千年的栽培歷史，種植面積居世界第5位，約為世界的4.5%以上[4]。苜蓿喜中性或微堿性土壤（pH 6.7～7.5，pH<6.7，則土壤pH偏低），產(chǎn)量便會(huì)隨pH的下降而迅速降低[5]。我國(guó)南方地區(qū)土壤普遍偏酸性，致使苜蓿的種植受到極大限制，雖通過(guò)引種與培育新品種得到初步試驗(yàn)推廣，但想要使苜蓿在南方地區(qū)持續(xù)長(zhǎng)足發(fā)展，亟需解決苜蓿與酸性環(huán)境的適應(yīng)問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外對(duì)苜蓿耐酸鋁性從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化代謝及分子水平上積累了許多研究成果，如Naras i m ha moorthy等[6]以二倍體苜蓿為材料，采用RFLP進(jìn)行QTL分析，篩選出4個(gè)耐鋁性的標(biāo)記。Naras i m ha moorthy等[7]研究認(rèn)為二倍體苜蓿M. sativa ssp. Coerulea具有較高的耐鋁性，四倍體紫花苜?；螂s合性較高，對(duì)耐鋁性品種選育有一定困難。李智燕[7]比較天藍(lán)苜蓿與紫花苜蓿耐鋁性及及其根瘤菌生長(zhǎng)的耐酸鋁性，認(rèn)為天藍(lán)苜蓿的耐鋁性優(yōu)于紫花苜蓿，其根瘤菌也較之紫花苜蓿根瘤菌有較強(qiáng)的耐酸鋁性。楊丹娜等[8]研究單一酸、鋁及酸鋁共同脅迫對(duì)苜蓿種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響認(rèn)為，共同脅迫的影響大于單一脅迫，pH<4.5、Al3+離子達(dá)50 mg/L以上時(shí)，苜蓿幼苗生長(zhǎng)明顯受抑。邱曉等[9]采用水培試驗(yàn)對(duì)27個(gè)紫花苜蓿品種的耐酸鋁性評(píng)價(jià)認(rèn)為，基因型不同，其對(duì)酸鋁耐性不同，通過(guò)聚類分析得出巨人802、豐寶、WL525和薩蘭多為耐鋁性較好的品種。但不同研究者由于使用的材料不同，耐酸鋁性評(píng)價(jià)指標(biāo)體系不同，難以再現(xiàn)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果，仍缺乏特異耐酸鋁強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)苜蓿資源。

云南分布有豐富的紫花苜蓿（M. sativa L.）、天藍(lán)苜蓿（Medicago lupulina L）、毛苜蓿（M. edgeworthii Sirj. Ex Hand. Mazz.）和南苜蓿（M. polymorpha L.）4種野生苜蓿資源[10-11]。野生資源對(duì)當(dāng)?shù)貧夂蚣巴寥罈l件有相對(duì)強(qiáng)的適應(yīng)能力，近年來(lái)，云南由于發(fā)展畜牧業(yè)的需要，急需大量生產(chǎn)豆科牧草，科技研究者對(duì)本地野生苜蓿開展了許多研究工作[12-19]，然而對(duì)苜蓿耐酸鋁性的研究積累仍欠缺。因此，本研究擬采用云南野生天藍(lán)苜蓿、德欽紫花苜蓿為材料，研究酸、鋁單一脅迫和復(fù)合脅迫下幼苗生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝變化，以期能夠?yàn)槟戏剿嵝酝寥老履退徜X苜蓿的選育提供理論依據(jù)，并為苜蓿在南方農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試天藍(lán)苜蓿（M. lupulina L.）采自于云南羅平板橋鎮(zhèn)，由羅平縣工信局區(qū)力松饋贈(zèng)，德欽紫花苜蓿（Medicago sativa L.）采自于云南迪慶德欽縣金沙江干熱河谷區(qū)。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 挑選飽滿、無(wú)損害的苜蓿種子，用0.1%的HgCl2消毒8 min后，無(wú)菌水沖洗5次后放入育苗盤于玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行育苗，待幼苗長(zhǎng)出2片真葉后，每個(gè)苜蓿資源挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，用脫脂棉為固定物固定于有孔泡沫板上，適應(yīng)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行酸、鋁脅迫處理，每處理3次重復(fù)，Hoag land營(yíng)養(yǎng)液+不同濃度酸、鋁培養(yǎng)，期間每3 d換1次營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液以濕潤(rùn)棉花即可，共培養(yǎng)10 d后測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

酸脅迫：用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。

Al3+脅迫：用AlCl3為鋁源，Al3+濃度為0、50、100、200、300、400、500 mg/L。

酸鋁脅迫：pH 4.5對(duì)應(yīng)Al3+濃度為0、50、100、200、300 mg/L。

1.2.2? 測(cè)量指標(biāo)與方法? 根長(zhǎng)、株高：分別測(cè)定脅迫前、后的株高和根長(zhǎng)，計(jì)算相對(duì)根長(zhǎng)和株高。相對(duì)抑制率=（對(duì)照?脅迫處理）/對(duì)照×100%。

生物量：從每個(gè)處理中隨機(jī)取出10株，電子天平上稱量幼苗的重量，計(jì)算單株均值。

根系活力采用TTC比色法測(cè)定[20]，葉綠素含量采用乙醇提取法[20]，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[21]、過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法[21]、超氧化物岐化酶（SOD）活性采用NBT法測(cè)定[21]。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

利用Excel7.0、SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 酸脅迫對(duì)2種苜蓿資源幼苗生長(zhǎng)的影響

2種苜蓿資源幼苗生長(zhǎng)對(duì)酸的脅迫響應(yīng)見(jiàn)表1。從表1可知，天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿其幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量及根系活力隨pH的降低而降

低，各處理間均具有顯著性差異。pH 7.0時(shí)2種苜蓿各測(cè)定指標(biāo)均獲得最大值，pH 3.0時(shí)各指標(biāo)值最小，與pH 3.0對(duì)比，pH 7.0天藍(lán)苜蓿根長(zhǎng)、株高、生物量、根系活力增幅分別為262.5%、225.0%、35.4%和165.3%，紫花苜蓿增幅分別為281.1%、316.0%、37.9%和187.3%。2種苜蓿相比較，pH 7.0時(shí)根長(zhǎng)、株高、生物量其變化幅度不大;pH≤6.0，相同處理中，天藍(lán)苜蓿根長(zhǎng)，株高和生物量均比紫花苜蓿要高;同一處理中根系活力天藍(lán)苜蓿均比紫花苜蓿強(qiáng)。其說(shuō)明2種苜蓿對(duì)酸脅迫均表現(xiàn)敏感，紫花苜蓿對(duì)酸更加敏感。

2.2? 酸脅迫對(duì)2種苜蓿資源生理生化的影響

天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿幼苗葉綠素含量隨pH降低而下降，不同pH處理下均達(dá)到顯著性差異（表2）。天藍(lán)苜蓿幼苗中MDA含量隨pH的降低而上升，而pH 4.0時(shí)紫花苜蓿中MDA含量最高。MDA含量是植物膜系統(tǒng)對(duì)逆境的響應(yīng)反映，含量越高，膜受損越大。POD活性隨pH降低而下降，SOD活性隨pH下降而上升，各處理均具顯著性差異。與pH 3.0處理相比，pH 7.0處理天藍(lán)苜蓿葉綠素含量增幅達(dá)113.2%，POD活性增幅為36.6%，MDA含量降幅為37.0%，SOD活性降幅為57.0%;而紫花苜蓿葉綠素含量增幅達(dá)141.9%，POD活性增幅為50.6%，MDA含量降幅為65.4%，SOD活性降幅為49.9%。

綜上所述，不同酸脅迫下，天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)及生理生化變化基本表現(xiàn)為：隨酸性增加其抑制作用越明顯。在所測(cè)定的8個(gè)指標(biāo)中，中性（pH 7.0）與強(qiáng)酸（pH 3.0）相比，7個(gè)指標(biāo)中天藍(lán)苜蓿的增幅或降幅比紫花苜蓿的測(cè)定值變化大，說(shuō)明紫花苜蓿幼苗對(duì)強(qiáng)酸處理更為敏感。

2.3? 鋁脅迫對(duì)2種苜蓿資源幼苗生長(zhǎng)的影響

不同濃度鋁脅迫對(duì)2種苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表3。由表3可知，鋁脅迫均會(huì)抑制2種苜蓿的根長(zhǎng)、株高、生物量及根系活力，受抑制程度隨鋁濃度的增加而增減，鋁離子為0～400 mg/L之間時(shí)，各處理間均具有顯著差異。與對(duì)照（Al3+為0 mg/L）相比，Al3+為500 mg/L天藍(lán)苜蓿根長(zhǎng)、株高、生物量與根系活力4個(gè)指標(biāo)上，其抑制率分別為72.5%、67.9%、71.2%和67.50%，紫花苜蓿其抑制率分別為77.1%、71.2%、71.9%和77.4%。比較而言，紫花苜蓿高鋁脅迫時(shí)，抑制率比天藍(lán)苜蓿要高。

2.4? 鋁脅迫對(duì)2種苜蓿資源幼苗生理生化的影響

不同濃度鋁脅迫對(duì)2種苜蓿幼苗生理生化的影響見(jiàn)表4。從表4可知，不同鋁濃度處理對(duì)2種苜蓿在葉綠素含量，MDA含量、POD及SOD活性均產(chǎn)生不同影響，其葉綠素含量和SOD活性隨鋁離子濃度的增加而下降，MDA含量和POD活性隨鋁離子濃度的增加而升高。其中，與對(duì)照相比，Al3+為500 mg/L處理天藍(lán)苜蓿葉綠素含量抑制率為74.6%，POD活性抑制率為31.8%，MDA含量增幅為79.4%，SOD活性增幅為61.1%;而紫花苜蓿葉綠素含量抑制率為80.2%，POD活性抑制率為30.9%，MDA含量增幅為43.3%，SOD活性增幅為55.6%。

綜上所述，不同鋁濃度處理時(shí)，天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)及生理生化變化基本表現(xiàn)為：隨鋁濃度增加其抑制作用越明顯。在高鋁脅迫下，8個(gè)測(cè)定指標(biāo)中，紫花苜蓿根長(zhǎng)、株高、生物量、根系活力、葉綠素含量的抑制率比天藍(lán)苜蓿高，丙二醛含量、SOD和POD活性表現(xiàn)相反趨勢(shì)。MDA含量、SOD和POD活性表現(xiàn)相反趨勢(shì)。

2.5? 酸鋁脅迫對(duì)2種苜蓿資源幼苗生長(zhǎng)的影響

當(dāng)pH為4.5時(shí)，不同濃度鋁脅迫對(duì)2種苜蓿幼苗生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表5。由表5可知，幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量及根系活力隨著鋁濃度的增加而降低，其天藍(lán)苜蓿抑制率分別為81.1%、78.2%、55.0%和64.2%。紫花苜蓿抑制率分別為84.7%、85.0%、61.4%和66.1%。從比較看出，高鋁脅迫時(shí)紫花苜蓿抑制率比天藍(lán)苜蓿要高，說(shuō)明天藍(lán)苜蓿相較紫花苜蓿耐酸鋁脅迫。

2.6? 酸鋁脅迫對(duì)2種苜蓿資源幼苗生理生化的影響

當(dāng)pH為4.5時(shí)，不同濃度鋁脅迫對(duì)2種苜蓿幼苗生理生化的影響見(jiàn)表6。由表6可知，酸鋁脅迫處理對(duì)2種苜蓿在葉綠素含量，MDA含量、POD及SOD活性均產(chǎn)生不同影響，其葉綠素含量隨鋁離子濃度的增加而下降，MDA含量隨鋁離子濃度的增加而升高，而POD和SOD活性在天藍(lán)苜蓿與紫花苜蓿之間變化有所不同，天藍(lán)苜蓿POD和SOD活性低酸鋁脅迫（Al3+ 50 mg/L）先增后降，紫花苜蓿POD活性隨鋁濃度的增加先增后降，SOD活性隨鋁濃度的增加而下降。與對(duì)照相比，Al3+ 300 mg/L處理天藍(lán)苜蓿葉綠素含量抑制率為77.3%，POD活性抑制率為31.7%，SOD抑制率為35.7%，MDA含量增幅為47.4%;而紫花苜蓿葉綠素含量抑制率為84.4%，POD活性抑制率為39.9%，SOD抑制率為47.8%，MDA含量增幅為48.1%。

3? 討論

酸鋁脅迫時(shí)，根系是最先作用的器官，根系感受逆境脅迫信號(hào)后，通過(guò)激發(fā)信號(hào)分子轉(zhuǎn)導(dǎo)后，調(diào)節(jié)自身抗氧化酶類及蛋白表達(dá)，調(diào)整自身生理代謝適應(yīng)逆境，因此，根系對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力能直觀反映對(duì)酸、鋁的耐受性，如果根系生長(zhǎng)受抑，其相應(yīng)的株高、產(chǎn)量等均會(huì)受到影響。本研究中，2種苜蓿資源在酸脅迫下幼苗生長(zhǎng)均受到影響，但天藍(lán)苜蓿的生長(zhǎng)優(yōu)于德欽紫花苜蓿，說(shuō)明一定酸度處理下，天藍(lán)苜蓿對(duì)酸的耐受性優(yōu)于紫花苜蓿。2種苜蓿在測(cè)定的各指標(biāo)中，根系長(zhǎng)度、根系活力、株高、生物量、葉綠素含量、POD活性隨pH的降低而降低，pH 3.0時(shí)受抑最嚴(yán)重，pH 7.0生長(zhǎng)最好。這一研究結(jié)果與楊丹娜等[8]、李劍峰等[22]對(duì)紫花苜蓿酸脅迫強(qiáng)酸嚴(yán)重抑制，而弱酸有促進(jìn)發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的研究結(jié)論不一致。MDA含量在2種苜蓿之間稍有變化，天藍(lán)苜蓿中含量隨pH的降低而上升，而紫花苜蓿中pH 4.0時(shí)含量最高，這可能是由于紫花苜蓿對(duì)酸的耐受性為4.0時(shí)已到一定極限。

單一鋁脅迫下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，不同濃度鋁脅迫下，天藍(lán)苜蓿和紫花苜蓿幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量及根系活力均受到不同抑制，不同處理間均有顯著差異。與對(duì)照相比，同一測(cè)定指標(biāo)中，Al3+ 500 mg/L紫花苜蓿的抑制率高于天藍(lán)苜蓿，說(shuō)明天藍(lán)苜蓿耐鋁能力高于紫花苜蓿。

酸鋁復(fù)合處理時(shí)，2種苜蓿幼苗根長(zhǎng)、株高、生物量及根系活力隨著鋁濃度的增加而降低，與對(duì)照相比，天藍(lán)苜蓿抑制率分別為81.1%、78.2%、55.0%和64.2%。紫花苜蓿抑制率分別為84.7%、85.0%、61.4%和66.1%。天藍(lán)苜蓿葉綠素含量抑制率為77.3%，POD活性抑制率為31.7%，SOD抑制率為35.7%，MDA含量增幅為47.4%;而紫花苜蓿葉綠素含量抑制率為84.4%，POD活性抑制率為39.9%，SOD抑制率為47.8%，MDA含量增幅為48.1%。比較單一酸、單一鋁及酸鋁共同脅迫，不難發(fā)現(xiàn)單一酸處理對(duì)苜蓿形態(tài)指標(biāo)的影響沒(méi)有單一鋁影響大，而酸鋁共脅迫其抑制作用最為明顯，其研究結(jié)論與楊丹娜等[8]的研究一致。有所差異的是楊丹娜等[8]研究認(rèn)為pH低于6.0才會(huì)有毒害作用，而本研究中pH低于7.0均會(huì)產(chǎn)生抑制。逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)MDA含量變化反映了細(xì)胞膜受損程度，POD和SOD活性的高低呈現(xiàn)出抵抗逆境的程度[23]。本研究中，酸度越高，鋁濃度越高，MDA含量越高，POD活性越低，SOD活性隨著脅迫強(qiáng)度的增加均有明顯上升趨勢(shì)，從評(píng)價(jià)的8個(gè)指標(biāo)分析，天藍(lán)苜蓿對(duì)酸鋁的耐受性比紫花苜蓿要強(qiáng)。

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