董云萍 閆林 黃麗芳 林興軍 孫燕 王曉陽 龍宇宙

摘? 要：為明確不同基因型小粒種咖啡的氮素吸收特性，進(jìn)一步為遺傳改良咖啡氮營養(yǎng)性狀提供參考，本研究對(duì)同一氮素供應(yīng)水平下20個(gè)小粒種咖啡氮素吸收效率的生理、形態(tài)機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果表明：大部分小粒種咖啡種質(zhì)間葉綠素含量、硝酸還原酶活性（NRA）、根氮、莖氮、葉氮含量差異不顯著，且葉綠素含量及NRA與葉氮、總氮累積量和氮吸收效率間相關(guān)性不顯著;根長(zhǎng)、根體積、根表面積均與根氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率呈顯著正相關(guān);氮素在植株各器官的分配比例依次為：根氮>葉氮>莖氮;聚類分析表明，‘M13氮吸收效率最高，為84.43%，最低為‘CATUAI，僅為32.12%，其余種質(zhì)為58.36%～43.08%。

關(guān)鍵詞：小粒種咖啡;氮素;吸收效率中圖分類號(hào)：S571.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis of Nitrogen Uptake of 20 Coffea arabica L. Accesions

DONG Yunping1，2， YAN Lin1，2，3， HUANG Lifang1，2，3， LIN Xingjun1，2， SUN Yan1，2， WANG Xiaoyang1，2，3， LONG Yuzhou1，2*

1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China; 3. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract： A pot experiment with the same nitrogen level was carried out to analyze the root morphological and physiological properties which affecting the nitrogen uptake efficiency of 20 arabica coffee genotypes to understand the characteristic of nitrogen uptake and to provide a material basis for the selective breeding. There were no significant difference in chlorophyll content， nitrate reductase activity （NRA）， nitrogen content in root （NCR）， nitrogen content in stem （NCS）， nitrogen content in leaf （NCL） among most genotypes. There existed rather weak correlation among chlorophyll content， NRA， N accumulation in leaf （NAL）， N accumulation in total （NAT） and N uptake rate （NUR）. Root length， root volume and root surface area were positively correlated with root nitrogen accumulation， NAT and NUR. The nitrogen distribution order was NCR>NCL>NCS. Cluster analysis demonstrated that the highest NUR was ‘M13 （84.43%）， the lowest was ‘CATUAI （32.12%）， and the rest was 58.36%-43.08%.

Keywords： Coffea arabica L.; nitrogen; uptake rate

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.001

氮是作物不可缺少的營養(yǎng)元素之一，作物各個(gè)器官的形成和發(fā)育均需要大量的氮素?？Х冉Y(jié)果量大，對(duì)氮、磷、鉀的需要量較大。蔡志全等[1]研究表明，氮缺乏對(duì)小粒種咖啡生長(zhǎng)、光合特性和產(chǎn)量的影響最大，其次為鉀，而磷的影響相對(duì)較小。據(jù)國外資料顯示，年產(chǎn)1 kg咖啡干豆需純氮0.1 kg。印度中央咖啡研究所從大量的肥料試驗(yàn)推斷，每年咖啡氮素的需要量是90～160 kg/hm2。Sala manca-Jimenez等[2]開展施肥對(duì)營養(yǎng)期咖啡氮利用效率的影響研究，雖然施氮在4個(gè)月后提供了約20%～29%的植株氮，但來自于肥料氮的利用率僅5%。氮肥的施用對(duì)咖啡產(chǎn)量和品質(zhì)的提高均起到了巨大的作用，有力地推動(dòng)了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但同時(shí)N肥的過量施用使得其利用率明顯下降，造成了化肥資源和經(jīng)濟(jì)的損失，也導(dǎo)致水體和大氣的污染以及產(chǎn)品品質(zhì)的下降。

作物無論在不同種屬之間還是同一種作物的不同品種之間均存在氮效率的差異。其差異主要表現(xiàn)在吸收硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的能力、硝酸還原酶水平、體內(nèi)無機(jī)氮儲(chǔ)存庫大小、氮素在體內(nèi)的再利用等方面[3]。根據(jù)作物基因型的差異選育氮高效品種，減少氮肥用量，提高氮肥的利用效率已在玉米[4]、小麥[5]、水稻[6]、油菜[7]等作物上進(jìn)行了深入的研究。

國外學(xué)者利用15N標(biāo)記的方法對(duì)咖啡植株各部分對(duì)氮的吸收利用進(jìn)行研究，從而評(píng)估氮肥農(nóng)學(xué)利用效率，但由于其方法取樣手段、檢測(cè)水平的限制，研究結(jié)果存在較大誤差[8]。而對(duì)咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行氮效率篩選研究未見報(bào)道。本研究通過盆栽試驗(yàn)對(duì)咖啡種質(zhì)做了篩選，以期發(fā)現(xiàn)咖啡氮利用高效和低效種質(zhì)，探究不同種質(zhì)氮效率差異的農(nóng)學(xué)機(jī)制和生理學(xué)機(jī)制，為發(fā)掘優(yōu)良的咖啡種質(zhì)資源，進(jìn)一步為遺傳改良咖啡氮營養(yǎng)性狀提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

2013年1月從農(nóng)業(yè)農(nóng)村部瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所咖啡種質(zhì)圃采集20個(gè)小粒種咖啡種質(zhì)成熟鮮果，種質(zhì)名稱及來源見表1。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)? 各種質(zhì)咖啡鮮果經(jīng)脫皮、脫膠、涼干后沙床催芽，待子葉平展時(shí)移植到直徑10 cm、高12 cm營養(yǎng)袋培育，5對(duì)真葉時(shí)轉(zhuǎn)入直徑25 cm、高30 cm塑料花盆培育，培育基質(zhì)為中細(xì)河沙，每個(gè)種質(zhì)20盆。按改良霍格蘭方法配制營養(yǎng)液，濃度為：Ca（NO3）2·4H2O 4.0 mmol/L、KNO3 5.0 mmol/L、NH4NO3 1.0 mmol/L、KH2PO4 1.0 mmol/L、MgCl2·6H2O 2.5 mmol/L、FeSO4·7H2O 20.0 μmol/L。6月齡前每次每株施1/3濃度配制營養(yǎng)液300 mL，共施3次;6～15月齡每次每株施配制營養(yǎng)液500 mL，1.5個(gè)月施1次，共施6次。

1.2.2? 測(cè)定方法? （1）葉綠素含量測(cè)定苗齡。15個(gè)月時(shí)，選擇每個(gè)種質(zhì)生長(zhǎng)一致的苗木5株掛牌，每1植株選取從頂芽往下數(shù)第3對(duì)成熟葉片，采摘其中1片帶回實(shí)驗(yàn)室用純水沖洗葉片，吸水紙擦干葉片水分后，用剪刀剪取不帶主脈的葉片0.2000 g（精確到0.0001 g），新鮮葉片切碎后放入25 mL容量瓶中，在容量瓶中加入純丙酮∶無水乙醇∶蒸餾水（4.5∶4.5∶1.0）的混合液15 mL，并仔細(xì)將黏附在瓶壁上的葉片洗到混合提取液中，定容到刻度后，在25～30 ℃恒溫箱中浸提過夜，期間搖動(dòng)1～2次，次日取出，觀察葉片組織如果完全變白，則表示葉綠素已經(jīng)浸提干凈，然后在波長(zhǎng)為645 nm和663 nm下用分光光度計(jì)分別比色測(cè)定其光密度值。

（2）硝酸還原酶活性測(cè)定。用活體法，選擇掛牌的每個(gè)種質(zhì)植株選取從頂芽往下數(shù)第3對(duì)成熟葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室用純水沖洗葉片，吸水紙擦干葉片水分后，稱0.3 g葉樣，將葉片剪成0.2～0.3 cm小方塊，放入裝有混合液（4 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液+5 mL 0.2 mol/L硝酸鉀溶液）的注射器中，對(duì)照先加1 mL 30%三氯乙酸，再加混合液，在黑暗條件下反復(fù)抽氣直到放氣后葉片變軟并沉入液體，30 ℃暗條件下保溫30 min，取出后立即加入1 mL 30%三氯乙酸終止酶反應(yīng)。吸取上清液1 mL于另一試管中，加入2 mL 1%對(duì)氨基苯磺酸和2 mL 0.2% α-萘胺，室溫顯色30 min后測(cè)定520 nm波長(zhǎng)下的光密度值。

（3）根系形態(tài)及生物量的測(cè)定。苗齡15個(gè)月時(shí)從每個(gè)種質(zhì)中選生長(zhǎng)一致的苗木3株，脫盆后，將根部的泥沙用自來水沖洗干凈，帶回實(shí)驗(yàn)室，每株分成葉片、莖干、根共3部分，用吸水紙吸干根部水分后，分別稱量各部分鮮重。將根系分成側(cè)根和主根2部分，放置于有水的根盒中，讓側(cè)根舒展不重疊，用根系掃描儀掃描，Win RHIZO 2013分析主根長(zhǎng)、側(cè)根長(zhǎng)、主根直徑、側(cè)根直徑、根體積、根表面積，測(cè)定完成后將全株各部分放置于烘箱，105 ℃殺青30 min，75 ℃烘干至恒重，分別稱其干重。

（4）氮素含量的測(cè)定。取烘干的每個(gè)種質(zhì)葉片、莖干、根各3 g，用植物樣品粉碎機(jī)磨碎，杜馬斯定氮儀NDA701測(cè)定。

1.2.3? 計(jì)算方法? 葉綠素a含量（mg/g）=[（12.7? OD663?2.59?OD645）?V]/（FW×1000）

葉綠素b含量（mg/g）=[（22.9?OD645?4.67? OD663）?V]/（FW?1000）

總?cè)~綠素含量=葉綠素a含量+葉綠素b含量

式中：OD663表示樣液在波長(zhǎng)663 nm下的光密度值，OD645表示樣液在波長(zhǎng)645 nm下的光密度值，V為定容體積，F(xiàn)W為稱取的葉樣鮮重。

氮素累積量 = 植株各部分干重 × 各部分氮素含量

氮素吸收效率 = 植株總氮累積量/生長(zhǎng)期供氮量?100%

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010軟件整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件中的ANOVA進(jìn)行方法分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，采用系統(tǒng)聚類法進(jìn)行聚類分析，采用Pearson相關(guān)法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同小粒種咖啡種質(zhì)葉綠素含量、硝酸還原酶活性及氮含量差異分析

由表2可見，‘CATURRA和‘CA ZHONG I葉綠素含量顯著高于‘M14、‘RUME SUDAN、‘CAT IMOR P1等12個(gè)種質(zhì);‘M2、‘鐵畢卡、‘DTARI 028等7個(gè)種質(zhì)葉綠素含量較低，為3.56～3.09 mg/g，顯著低于綠素含量為4.70～ 4.21 mg/g的‘CATURRA和‘CA ZHONG I、‘CATUAI等8個(gè)種質(zhì)，其余種質(zhì)間葉綠素含量差異不顯著，葉綠素含量最低的‘德熱296葉片為紫色。

‘T8867、‘M10葉片硝酸還原酶活性顯著高于‘CATURRA、‘鐵比卡、‘波幫等14個(gè)種質(zhì)，‘熱引2、‘CA ZHONG Ⅲ、‘DTARI 028等5個(gè)種質(zhì)葉片硝酸還原酶活性較低，為14.61～9.34 mg/（g·h），顯著低于硝酸還原酶活性為32.81～21.36 mg/（g·h）的‘T8867、‘M10、‘CIFC 7963等10個(gè)種質(zhì)，其余種質(zhì)間差異不顯著。

通過分析可知，咖啡種質(zhì)葉綠素含量高，其葉片硝酸還原酶活性也高，但‘RUME SUDAN、‘CA ZHONG III、‘M10、‘巴矮、‘波幫、‘德熱296、‘熱引2和‘鐵畢卡例外。

‘CA ZHONG II根氮含量顯著高于其余種質(zhì)，‘M14根氮含量最低，與‘巴矮差異不顯著，與其余種質(zhì)差異顯著?！瓹A ZHONG IIII莖氮含量顯著高與其余種質(zhì)，但其余種質(zhì)間差異不顯著?！瓹A ZHONG II葉氮含量顯著高于‘M13，且這2個(gè)種質(zhì)葉氮含量顯著高于其余種質(zhì)，其余種質(zhì)間葉氮含量差異不顯著。可見，測(cè)定的大部分小粒種咖啡種質(zhì)間根氮、莖氮、葉氮含量差異不大。從氮在植株各器官的分配來看，根氮含量較高，其次為葉氮，最低為莖氮。

2.2? 不同小粒種咖啡種質(zhì)根系生長(zhǎng)參數(shù)分析

由表3可見，‘M13側(cè)根長(zhǎng)顯著高于‘CATI M- OR P1、‘CATURRA、‘CATUAI等8個(gè)種質(zhì)，與‘T8867、‘S288、‘熱引2等11個(gè)種質(zhì)間差異不顯著。‘M13根體積除顯著于‘CATUAI外，與其余種質(zhì)間差異不顯著。

‘M13根表面積顯著大于‘波邦、‘RUME SUDAN、‘CATUAI等4個(gè)種質(zhì)，與其余種質(zhì)間差異不顯著。多重比較結(jié)果表明，大部分小粒種咖啡種質(zhì)間側(cè)根長(zhǎng)、根體積、根表面積差異不顯著。

2.3? 不同小粒種咖啡種質(zhì)氮累積量和氮吸收效率差異分析

由表4可見，‘M13根氮累積量最高，‘M13與‘CATIMOR P1、‘CIFC 7963、‘CA ZHONG I等8個(gè)種質(zhì)差異不顯著，而且‘CATIMOR P1、‘CIFC 7963、‘巴矮等14個(gè)種質(zhì)間差異不顯著;莖氮累積量最高為‘M13，‘M13與‘M14、‘RUME SUDAN、‘M2等5個(gè)種質(zhì)差異不顯著，‘RUME SUDAN與‘鐵畢卡、‘CA ZHONG I、‘M10等11個(gè)種質(zhì)間差異不顯著;‘M13葉氮累積量顯著高于‘CA ZHONG II，且這2個(gè)種質(zhì)葉氮累積量顯著高于其余種質(zhì)，剩余大部分種質(zhì)間差異不顯著。綜合表2、表3、表4可知，在大部分小粒種咖啡種質(zhì)間根氮、莖氮、葉氮含量差異不大的情況下，各種質(zhì)氮累積量大小主要取決于植株各部分干物質(zhì)累積量，雖然‘CA ZHONG II根氮、莖氮含量較高，但由于其根和莖干物質(zhì)累積量小，因而其相應(yīng)部位氮累積量小?！甅13總氮累積量、氮吸收效率顯著高于其余種質(zhì)，其余大部分種質(zhì)間差異不顯著。

對(duì)20個(gè)小粒種咖啡種質(zhì)氮吸收效率進(jìn)行聚類分析，分為3類（圖1）。氮吸收效率最高的種質(zhì)為‘M13，氮吸收效率達(dá)84.43%，最低為‘CA T UAI，僅為32.12%，其余種質(zhì)氮吸收效率為58.36%～ 43.08%。

2.4? 不同小粒種咖啡種質(zhì)各參數(shù)間的相關(guān)性分析

不同小粒種咖啡種質(zhì)各參數(shù)間相關(guān)性分析結(jié)果見表5，葉片硝酸還原酶活性與葉氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率間相關(guān)性不顯著;同樣，葉綠素含量與葉氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率相關(guān)性不顯著;根長(zhǎng)、根體積、根表面積均與根氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率呈顯著正相關(guān)。

3? 討論

植物吸收的主要無機(jī)氮形式是銨（NH4+）和硝酸鹽（NO3-），硝酸還原酶是植物氮代謝的關(guān)鍵酶。研究表明，作物品種的氮素同化能力與各生育期硝酸還原酶活性表現(xiàn)為不同程度的正相關(guān)[9]。朱德群等[10]、鄭元明[11]研究表明，小麥苗期氮積累總量和硝酸還原酶活性呈顯著正相關(guān)。在施氮條件下，油菜氮高效品種功能葉的葉綠素含量和硝酸還原酶活性較強(qiáng)[12]。張旭等[13]研究表明，小麥氮高效型品種開花期其葉的葉綠素和氮含量、凈光合速率、硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性較高。然而Eicheloerger等[14]報(bào)道，以NRA為指標(biāo)對(duì)玉米進(jìn)行選擇到8代時(shí)，高NRA品系的NRA己達(dá)到低NRA的4倍，然而兩者的產(chǎn)量都比原親本低，故NRA在實(shí)際育種中的價(jià)值難以確定。本研究在施氮量相同的情況下，對(duì)20個(gè)小粒種咖啡種質(zhì)葉片硝酸還原酶活性分析表明，大部分咖啡種質(zhì)間NRA差異不顯著，且NRA與葉氮累積量、總氮累積量和氮吸收效率間相關(guān)性不顯著。NRA是否可作為篩選咖啡氮高效品種的指標(biāo)有待進(jìn)一步的研究。莫良玉等[15]研究表明，由谷氨酰胺合成酶（Gs）和谷氨酸合成酶（GOGAT）催化的氨（NH4+）同化為有機(jī)含氮化合物的同化途徑，即Gs-GOGAT途徑才是植物氨同化更為普遍和重要的方式。GS被認(rèn)為與作物的氮效率[16]和耐低氮性[17]有關(guān)。Tiago等[18]研究表明，在缺氮的條件下，NH4+是小粒種咖啡根首選的無機(jī)氮源。因此，有必要進(jìn)一步開展不同咖啡種質(zhì)Gs活性及其與咖啡氮素效率的相關(guān)性研究。

氮素是葉綠素的主要成分，施氮一般能促進(jìn)植物葉片葉綠素的合成，增強(qiáng)光合作用。葉片含氮量與葉綠素含量有著較強(qiáng)的指數(shù)函數(shù)關(guān)系，在一定條件下，可根據(jù)作物葉綠素含量確定葉片含氮量[19]。劉代平等[20]研究認(rèn)為，在施氮條件下油菜功能葉葉綠素含量與氮效率密切相關(guān)，但在不施氮條件下，油菜功能葉葉綠素含量對(duì)氮效率影響較小。本研究結(jié)果，葉綠素含量與葉片氮含量間沒有對(duì)應(yīng)關(guān)系，葉綠素含量較高的種質(zhì)如‘CA T U RRA、‘CA ZHONG I、‘CATUAI、‘T8867，其葉片氮含量并不高，葉綠素含量與葉氮累積量、總氮累積量、氮吸收效率相關(guān)性不顯著。這可能與大部分小粒種咖啡品種間葉綠素含量差異不大有關(guān)，另一方面，小粒種咖啡品種葉綠素含量受光照強(qiáng)度、水分等因素的影響更大。

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