盧傳禮

〔1. 廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)， 廣東 廣州 510316； 2. 中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園， 云南 西雙版納 666303〕

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，中國(guó)酒精性肝病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，目前，已成為僅次于傳染性肝病的第2大類肝病[1]，因此，尋找防治酒精性肝病的有效藥物具有重要的臨床和社會(huì)意義。

鐮葉西番蓮(PassiflorawilsoniiHemsl.)隸屬于西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(PassifloraLinn.)，分布于中國(guó)云南以及緬甸、泰國(guó)、老撾和越南等國(guó)家[2]，其地上部分又名鍋鏟葉，為中國(guó)西南地區(qū)少數(shù)民族的常用藥物，常與其他藥材配伍用于治療急性黃疸型肝炎、肝硬化、肝炎和肝硬化腹水等肝臟疾病[3-7]。鐮葉西番蓮含有三萜、甾醇和黃酮類成分[8-10]。目前，關(guān)于鐮葉西番蓮有效成分及生理活性的報(bào)道較少。本研究首次運(yùn)用乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型對(duì)鐮葉西番蓮的護(hù)肝效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為鐮葉西番蓮的傳統(tǒng)臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，并為防治酒精性肝病開拓新資源。

1 材料和方法

1.1 材料

供試鐮葉西番蓮地上部分于2017年10月采自云南省西雙版納傣族自治州勐遮鎮(zhèn)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園肖春芬高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定。憑證標(biāo)本(HITBC091711)保存于中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園植物標(biāo)本館(HITBC)。

供試4周齡雄性NIH小鼠(18～22 g)由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(粵)2013-0002，倫理委員會(huì)編號(hào)XTBG 2017-07-001。飼養(yǎng)室溫度20 ℃～24 ℃，空氣相對(duì)濕度30%～70%。

聯(lián)苯雙酯滴丸(批號(hào)NF4006)購(gòu)自廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司；無(wú)水乙醇(優(yōu)級(jí)純)購(gòu)自廣東光華科技股份有限公司；血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(批號(hào)20170122)、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(批號(hào)20170212)、甘油三酸酯含量(批號(hào)20171218)和總膽固醇含量(批號(hào)20161222)以及肝臟組織中甘油三酸酯含量(批號(hào)20171228)的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司；血清中極低密度脂蛋白含量(批號(hào)20170725)以及肝臟組織中丙二醛含量(批號(hào)20170712)和超氧化物歧化酶活性(批號(hào)20170713)的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉(批號(hào)160072311)購(gòu)自上海申光食用化學(xué)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鐮葉西番蓮地上部分水提取物(WEPW)的制備 新鮮鐮葉西番蓮地上部分經(jīng)45 ℃鼓風(fēng)干燥，粉碎后過(guò)60目篩。取150 g粉末，加入1.5 L自來(lái)水加熱回流提取1.5 h，紗布過(guò)濾后收集濾液，濾渣用上述方法重復(fù)提取2次。合并3次濾液，減壓濃縮至約100 mL，冷凍干燥后得到WEPW 12.3 g。

1.2.2 動(dòng)物分組、造模和給藥 將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只。正常組(Ⅰ)和乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組(Ⅱ)小鼠以20 mL·kg-1·d-1劑量灌胃給予質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，陽(yáng)性對(duì)照組(Ⅲ)小鼠灌胃給予聯(lián)苯雙酯-質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5% CMC-Na溶液(聯(lián)苯雙酯劑量為200 mg·kg-1·d-1)，WEPW的低劑量組(Ⅳ)、中劑量組(Ⅴ)和高劑量組(Ⅵ)小鼠分別灌胃給予不同濃度WEPW-質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.5% CMC-Na溶液(WEPW劑量分別為100、200和400 mg·kg-1·d-1)。每天1次，持續(xù)7 d。從第5天開始，給藥4 h后，除Ⅰ組外，其他5組以12 mL·kg-1·d-1劑量灌胃給予體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，建立乙醇誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。記錄實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)小鼠的體質(zhì)量。末次給予體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液后禁食不禁水16 h，眼眶取血，于4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，-20 ℃保存、備用。取血完畢后處死小鼠，稱量肝臟質(zhì)量。然后取部分肝臟組織，-80 ℃保存、備用，另取一部分肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，利用Varioskan?Flash酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值，計(jì)算血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性以及甘油三酸酯和總膽固醇的含量，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，計(jì)算血清中極低密度脂蛋白含量。

1.2.4 肝臟相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 取部分肝臟組織剪碎，加入9倍質(zhì)量0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，充分勻漿后，于4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，取上清液。按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肝臟組織中甘油三酸酯含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。按照公式“肝臟指數(shù)=(肝臟質(zhì)量/實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)體質(zhì)量)×100%”計(jì)算肝臟指數(shù)。

1.2.5 肝臟組織病理學(xué)檢查 取部分肝臟組織，冷凍后切片(5 μm)，加入油紅O進(jìn)行染色，在BX41光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用PASW Statistics 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果和討論

鐮葉西番蓮地上部分水提取物(WEPW)對(duì)乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠血清和肝臟相關(guān)指標(biāo)的影響見(jiàn)表1，對(duì)其肝臟組織病理學(xué)的影響見(jiàn)圖1。

2.1 對(duì)血清相關(guān)指標(biāo)的影響

結(jié)果(表1)顯示：與正常組相比較，乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性以及甘油三酸酯、總膽固醇和極低密度脂蛋白的含量分別顯著或極顯著升高2.8、2.6、1.6和10.4倍，但谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無(wú)顯著變化，表明乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型造模成功。與乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組相比較，WEPW中劑量組和高劑量組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和甘油三酸酯含量顯著或極顯著降低，WEPW高劑量組血清中極低密度脂蛋白濃度含量顯著降低，但WEPW 3個(gè)劑量組均對(duì)血清中總膽固醇含量無(wú)顯著影響，說(shuō)明WEPW對(duì)乙醇誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷有明顯的預(yù)防作用。

組別Group血清相關(guān)指標(biāo) Related indexes of serum肝臟相關(guān)指標(biāo) Related indexes of liverALTASTTGTCVLDLLITGMDASODⅠ50.9±9.3155.5±26.31.13±0.304.53±0.540.17±0.104.36±0.230.42±0.050.53±0.19403.5±26.5Ⅱ142.0±24.2#213.9±40.22.89±0.90##7.26±1.26##1.76±0.44##6.81±0.41##0.97±0.27##1.54±0.34##236.3±26.6#Ⅲ35.8±16.0**152.3±44.91.12±0.34**6.96±1.490.38±0.22*5.46±0.39*0.46±0.08*0.69±0.24**377.2±28.9*Ⅳ96.8±22.3167.4±51.61.35±0.23*7.61±1.290.63±0.426.15±0.49*0.49±0.080.83±0.29269.1±54.6Ⅴ72.1±15.2*165.7±36.41.09±0.24**6.91±1.240.57±0.355.89±0.48*0.40±0.12**0.76±0.23*328.2±48.9*Ⅵ64.7±12.9*157.6±64.31.05±0.13**7.17±1.020.44±0.24*5.59±0.60*0.39±0.04**0.63±0.15*347.9±26.3*

1)Ⅰ： 正常組Normal group； Ⅱ： 乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組Ethanol-induced acute liver injury group； Ⅲ： 陽(yáng)性對(duì)照組Positive control group； Ⅳ： WEPW低劑量組WEPW group at low dose； Ⅴ： WEPW中劑量組WEPW group at middle dose； Ⅵ： WEPW高劑量組WEPW group at high dose. ALT： 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性Alanine aminotransferase activity (U·L-1)； AST： 谷草轉(zhuǎn)氨酶活性Aspartate aminotransferase activity (U·L-1)； TG： 甘油三酸酯含量Triglyceride content (mmol·L-1)； TC： 總膽固醇含量Total cholesterol content (mmol·L-1)； VLDL： 極低密度脂蛋白含量Very low-density lipoprotein content (μmol·L-1)； LI： 肝臟指數(shù)Liver index (%)； MDA： 丙二醛含量Malondialdehyde content (nmol·mg-1)； SOD： 超氧化物歧化酶活性Superoxide dismutase activity (nmol·mg-1). #和##分別表示與Ⅰ組間存在顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異 # and ## respect significant (P<0.05) and obviously significant (P<0.01) differences with group Ⅰ， respectively. *和** 分別表示與Ⅱ組間存在顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)差異 * and**respect significant (P<0.05) and obviously significant (P<0.01) differences with group Ⅱ， respectively.

2.2 對(duì)肝臟相關(guān)指標(biāo)的影響及病理學(xué)檢查結(jié)果

結(jié)果(表1)顯示：與正常組相比較，乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組小鼠的肝臟指數(shù)以及肝臟組織中甘油三酸酯和丙二醛的含量極顯著升高，超氧化物歧化酶活性顯著降低；與乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組相比較，WEPW中劑量組和高劑量組的肝臟指數(shù)以及肝臟組織中甘油三酸酯和丙二醛的含量顯著或極顯著降低，超氧化物歧化酶活性顯著升高，且作用強(qiáng)度具有濃度依賴性，說(shuō)明WEPW能夠改善乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)。此外，肝臟組織病理切片(圖1)顯示：WEPW 3個(gè)劑量組能夠有效改善乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝臟組織脂滴積累的狀況。

Ⅰ： 正常組Normal group； Ⅱ： 乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷模型組Ethanol-induced acute liver injury group； Ⅲ： 陽(yáng)性對(duì)照組Positive control group； Ⅳ： WEPW低劑量組WEPW group at low dose； Ⅴ： WEPW中劑量組WEPW group at middle dose； Ⅵ： WEPW高劑量組WEPW group at high dose.

圖1 鐮葉西番蓮地上部分水提取物(WEPW)對(duì)乙醇誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

Fig. 1 Effects of water extract from above-ground part ofPassiflorawilsoniiHemsl. (WEPW) on liver histopathology of mice with ethanol-induced acute liver injury

山楂酸是一種天然的五環(huán)三萜類化合物，可有效減輕乙醇誘導(dǎo)的小鼠肝臟氧化和炎性損傷[11]，抑制高血糖引起的大鼠肝臟氧化損傷[12]，抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[13]。鐮葉西番蓮含有山楂酸[8]，且作者測(cè)得WEPW中總?cè)祁惡扛哌_(dá)247.97 mg·g-1(未發(fā)表數(shù)據(jù))，推測(cè)山楂酸是鍋鏟葉保肝護(hù)肝的有效成分之一。

本研究首次證實(shí)了WEPW能夠有效預(yù)防乙醇導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷，并初步揭示其保肝護(hù)肝作用可能與改善肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，為其傳統(tǒng)的保肝護(hù)肝功效應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，但鐮葉西番蓮的臨床療效、藥理活性、有效成分和作用機(jī)制等方面亟待進(jìn)一步研究。