王秋蘭，王智蘭，韓 芳，杜曉芬，連世超，韓康妮，周 雪，李慧娟，張林義，王 軍，郭二虎

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 谷子研究所，雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 長(zhǎng)治 046011；2.延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 延安 716000)

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，葉片顏色與光合作用及產(chǎn)量密切相關(guān)[1-4]，谷子是C4植物的模式研究作物之一，它具有基因組小、二倍體植物、生育期短、抗旱性和耐瘠薄性極強(qiáng)等特點(diǎn)，因此，谷子葉色突變體已成為探究葉綠體發(fā)育機(jī)制和C4光能利用率的理想材料之一[5-7]。目前，在谷子中公開研究報(bào)道的葉色突變體非常少，Luo等[8]鑒定出14個(gè)具有異?！盎ōh(huán)型”結(jié)構(gòu)的葉色突變體，可用于今后“花環(huán)型”結(jié)構(gòu)發(fā)育和C4光合作用研究相關(guān)基因的定位和克隆。在已經(jīng)克隆的谷子葉色突變體中，SiYGL1編碼Mg-螯合酶的一個(gè)D亞基(CHLD)蛋白，該蛋白屬于編碼葉綠素合成途徑關(guān)鍵酶基因之一，該基因突變后葉片表現(xiàn)為黃綠色[9]；在葉綠體發(fā)育方面，SiSTL1[10]和SiSTL2[11]分別編碼核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase，RNR)大亞基蛋白和脫氧胞苷單磷酸脫氨酶(Deoxycytidine monophosphate deaminase，DCD)蛋白，其突變體表現(xiàn)出不同程度的條紋葉[10-11]。

與擬南芥、水稻和玉米等相比，目前，關(guān)于谷子葉色突變體及葉綠體相關(guān)分子機(jī)制方面的進(jìn)展不能滿足對(duì)其C4光合和葉綠體發(fā)育機(jī)制的研究，迫切需要利用更多的葉色突變體并發(fā)掘鑒定相關(guān)基因及其功能。

條紋葉表型受多個(gè)基因調(diào)控，其分子生物學(xué)機(jī)理較為復(fù)雜。影響葉綠體生物合成相關(guān)基因突變后造成葉片白條紋表型，研究表明，水稻V3和St1基因分別編碼核糖核苷酸還原酶大亞基蛋白(RNRL1)和核糖核苷酸還原酶小亞基蛋白(RNRS1)，這類基因在三葉期莖基部組織中高表達(dá)，即葉綠體發(fā)育第一階段，這2個(gè)基因突變后影響質(zhì)體DNA的合成，阻礙葉綠體分化[12]；水稻V1[13]、V2[14-15]和VYL[16]基因分別編碼NUS1、pt/mtGK和OsClpP6，該類基因在葉綠體發(fā)育的第二階段高度積累，其突變影響葉綠體遺傳機(jī)制的建立，阻礙葉綠體的形成，造成水稻白條紋表型[13-16]。WSL[17]、WSL4[18]和WSL5[19]屬于三角狀五肽(Pentatricopeptide Repeat，PPR)家族蛋白，與葉綠體中RNA代謝有關(guān)，其基因突變?cè)斐蓃pl2、rps12、atpA、atpF和ndhA等葉綠體轉(zhuǎn)錄本不能被正常編輯或剪切，導(dǎo)致葉片產(chǎn)生條紋[17-19]；還有一類定位于葉綠體類核中的蛋白，這些蛋白的主要功能是參與質(zhì)體轉(zhuǎn)錄，調(diào)控丙酮酸羧化酶(PEP)和RNA聚合酶有關(guān)基因的表達(dá)，如WLP2[20]、WSL3[21]和YSS1[22]，其突變后損壞PEP活性，造成白條紋表型[20-22]；WLP1基因編碼一個(gè)50S核糖體大亞基蛋白L13[23]，而WP1基因編碼一個(gè)纈氨酸-tRNA合成酶1[24]，它們主要參與調(diào)控葉綠體核糖體的發(fā)育，其突變體葉片表現(xiàn)為條紋表型，抽穗后幼穗表現(xiàn)白化[23-24]；而YSS2[25]和WSL12[26]編碼核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate kinase 2，NDPK2)蛋白，參與葉綠素的合成和光合作用，其基因突變后表現(xiàn)為條紋葉[25-26]。此外，編碼鉀離子通道蛋白的基因AM1突變后亦可造成葉片白條紋表型[27]。

在前期工作中，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院谷子研究所谷子分子育種課題組從谷子主推品種長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)的甲基磺酸乙酯(EMS)誘變庫(kù)中篩選鑒定到一個(gè)條紋葉突變體wsl2[28]，有關(guān)該突變體的遺傳機(jī)制尚不清楚。

本研究以谷子品種長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)條紋葉突變體wsl2為主要研究材料，以wsl2×野生型雜交自交F2分離群體為定位群體，采用MutMap技術(shù)進(jìn)行wsl2基因精細(xì)定位[29-30]，同時(shí)，開發(fā)、鑒定共分離標(biāo)記，并進(jìn)行wsl2候選基因預(yù)測(cè)，旨在揭示wsl2基因在谷子葉綠素含量和光合作用中的功能，為解析C4植物葉綠體的發(fā)育機(jī)制奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以谷子材料長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)為原始材料，經(jīng)EMS誘變獲得條紋葉色突變體wsl2。試驗(yàn)所用谷子材料均種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所試驗(yàn)田。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1wsl2突變體表型、遺傳背景、農(nóng)藝性狀及遺傳分析 于谷子苗期、拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期和成熟期分別對(duì)wsl2和野生型進(jìn)行葉片顏色表型調(diào)查；同時(shí)，選取谷子分子育種實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的50個(gè)谷子分子標(biāo)記(表1)對(duì)wsl2和野生型以及另外4份谷子材料品資39號(hào)、09K65、高88和K5-496進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，驗(yàn)證該突變體的遺傳背景。選取突變體wsl2與野生型各10株于成熟期進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查的農(nóng)藝性狀包括節(jié)數(shù)、株高、穗下節(jié)長(zhǎng)、節(jié)間粗、穗長(zhǎng)、穗粗、穗質(zhì)量及穗粒質(zhì)量等。突變體wsl2同野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)雜交獲得F1，觀察F1葉色情況。F1自交構(gòu)建F2分離群體，苗期(3～6葉)調(diào)查F2分離群體葉色分離情況，統(tǒng)計(jì)野生表型和條紋葉表型的植株數(shù)目，并進(jìn)行卡方測(cè)試，進(jìn)行突變體wsl2的遺傳分析。

1.2.2 通過MutMap方法克隆候選基因 本研究采用MutMap方法對(duì)候選基因進(jìn)行克隆[29-30]。wsl2與野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)雜交分離獲得F2群體，在苗期取30株條紋葉表型植株的葉片，提取DNA后等量混合并進(jìn)行全基因組測(cè)序，同時(shí)，野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)作為對(duì)照進(jìn)行基因組重測(cè)序(百邁克生物科技有限公司)。測(cè)序完成后，wsl2的混池?cái)?shù)據(jù)以及野生型的數(shù)據(jù)分別同參考基因組豫谷1號(hào)比對(duì)，得到SNPs數(shù)據(jù)集。然后，對(duì)染色體上的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行過濾，去掉長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)和混池DNA都有的SNPs，從而挑選出對(duì)于混池DNA特有的SNPs。最后計(jì)算每個(gè)SNPs的SNP-index，即SNP-index為該位點(diǎn)測(cè)到的突變序列的頻次除以該位點(diǎn)的總深度，而理論上由于候選SNP同表型完全連鎖，其SNP-index為1。挑選SNP-index接近1的區(qū)域?yàn)殛P(guān)聯(lián)區(qū)間，最后對(duì)關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)基因注釋后進(jìn)一步得到候選基因。

1.2.3 候選基因的進(jìn)一步確定 根據(jù)候選SNPs所在區(qū)域的DNA序列，采用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，分別以wsl2和野生型基因組DNA為模板，特異PCR產(chǎn)物回收后直接測(cè)序，根據(jù)峰圖判斷突變體中是否存在候選SNP。進(jìn)一步根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)dCAPS分子標(biāo)記或共分離標(biāo)記(表1)，對(duì)wsl2和野生型進(jìn)行檢測(cè)，從而確定突變位點(diǎn)是否真實(shí)存在。PCR擴(kuò)增總體積10 μL：模板1 μL，10× Buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μL，4 μmol/L特異引物1 μL，rTaqDNA聚合酶0.1 μL和ddH2O 6.1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 45～90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。引物SIsv0296b1、SIsv0078b2、SIsv1045b1、SIsv0546b1、MRI501-3和MRI498-1(Cac8Ⅰ)用8%非變性PAGE膠電泳，經(jīng)快速銀染后照相統(tǒng)計(jì)。引物MRI413和MRI414的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 所用引物信息

利用Phytozome(https:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias= Org_Sitalica)和PlantGDB(http://www.plantgdb.org/SiGDB/)數(shù)據(jù)庫(kù)查找定位區(qū)間內(nèi)的基因，對(duì)區(qū)間內(nèi)基因進(jìn)行功能注釋；同時(shí)結(jié)合SIFGD(http://structuralbiology.cau. edu.cn/SIFGD/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行候選基因的轉(zhuǎn)錄模式分析[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 wsl2突變體表型、遺傳背景及農(nóng)藝性狀分析

通過EMS誘變品種長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)，篩選得到一個(gè)條紋葉突變體，命名為wsl2。在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所試驗(yàn)田大田生長(zhǎng)情況下，wsl2在苗期表現(xiàn)為條紋葉表型，但從拔節(jié)期開始恢復(fù)為正常葉片表型，而野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)全生育期葉片表現(xiàn)均正常(圖1-A)。選用50對(duì)分子標(biāo)記對(duì)wsl2、野生型及另外4個(gè)谷子材料進(jìn)行檢測(cè)，突變體與野生型對(duì)照的條帶在凝膠上的相對(duì)位置一致，DNA片段大小相同，說(shuō)明突變體與野生型遺傳背景相同，不是其他品種混雜；而其余4個(gè)谷子品種的條帶與野生型在部分標(biāo)記間顯示出差異性(圖1-B-E)。在農(nóng)藝性狀方面，突變體wsl2與野生型相比，節(jié)數(shù)、株高、穗下節(jié)長(zhǎng)、節(jié)間粗、穗長(zhǎng)、穗粗、穗質(zhì)量及穗粒質(zhì)量等性狀上均無(wú)顯著差異(表2)。

A.wsl2和野生型苗期第4葉表型；B-E.分別為部分標(biāo)記SIsv0296b1、SIsv0078b2、SIsv1045b1和SIsv0546b1檢測(cè)突變體遺傳背景的電泳圖片；1-6.分別為WT(長(zhǎng)農(nóng)35號(hào))、wsl2、品資39號(hào)、09K65、高88和K5-496。

2.2 wsl2的遺傳學(xué)分析

2.3 基于MutMap的候選基因克隆

為了進(jìn)一步研究wsl2條紋葉形成的分子機(jī)制，本研究利用MutMap方法對(duì)突變體wsl2的候選基因進(jìn)行克隆[29-30]。從突變體與野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)雜交的F2群體中挑選出30株條紋葉表型植株，混池測(cè)序，同時(shí)對(duì)野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)進(jìn)行測(cè)序作為對(duì)照，然后進(jìn)行SNP分析。挑選SNP-index接近1的SNPs為候選SNPs。對(duì)染色體上的SNP位點(diǎn)進(jìn)行過濾，突變體wsl2共檢測(cè)到12 585個(gè)混池特異SNP，得到突變體混池SNP-index的分布圖(圖2)。

利用擬合后index的95百分位數(shù)即0.95，得到該染色體上包含基因的關(guān)聯(lián)區(qū)域共2個(gè)(表3)，區(qū)間總長(zhǎng)度為1.35 Mb，共包含184個(gè)基因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，親本與混池間存在非同義突變的SNP共18個(gè)，分布于9個(gè)基因上，即非同義突變的基因共9個(gè)，這些SNP或基因很有可能與突變性狀直接相關(guān)(表4)。

圖2 SNP-index值在染色體上的分布

表3 MutMap關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)

表4 突變體wsl2非同義突變位點(diǎn)分析

通過Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias= Org_Sitalica)和PlantGDB(http://www.plantgdb.org/SiGDB/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)非同義突變基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)Seita.9G561800是一個(gè)編碼與葉綠體相關(guān)的PsbP蛋白基因(表4)；同時(shí)，用SIFGD(http://structuralbiology.cau.edu.cn/SIFGD/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這9個(gè)非同義突變基因的轉(zhuǎn)錄模式進(jìn)行了分析[31]，根據(jù)基于FPKM的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)Seita.9G561800在葉部的表達(dá)明顯高于其他部位(圖3)。因此，該基因可能為wsl2的關(guān)鍵候選基因。

數(shù)據(jù)來(lái)源于SIFGD(http://structuralbiology.cau.edu.cn/SIFGD/)數(shù)據(jù)庫(kù)[31]。

2.4 突變位點(diǎn)的進(jìn)一步驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證突變體wsl2的候選突變位點(diǎn)，在突變位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物(表1)。PCR 擴(kuò)增及測(cè)序顯示，在野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)中，該位置為G，而在wsl2中，該位置為T(圖4-A)。因此，在wsl2中確實(shí)發(fā)生了突變。為了進(jìn)一步驗(yàn)證wsl2突變體的候選位點(diǎn)，根據(jù)突變堿基設(shè)計(jì)了dCAPS 標(biāo)記MRI498-1(cac8Ⅰ)(突變位點(diǎn)造成限制性內(nèi)切酶Cac8Ⅰ的差異)和共分離標(biāo)記MRI501-3(表1)。利用分子標(biāo)記檢測(cè)野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)和wsl2突變體，結(jié)果顯示，wsl2與野生型條帶存在差異，與預(yù)期結(jié)果相符合(圖4-B)。因此，wsl2中確實(shí)存在G-T突變，wsl2的條紋葉表型很可能是由基因Seita.9G561800的突變導(dǎo)致。

2.5 基因位點(diǎn)的功能分析

查詢谷子基因注釋網(wǎng)站(https: //phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html#!info? alias= Org_ Sita lica)，Seita.9G561800含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。其中，wsl2突變發(fā)生在第1外顯子77 bp處，導(dǎo)致一個(gè)精氨酸(R)變成亮氨酸(L)。Seita.9G561800編碼葉綠體相關(guān)的類PsbP蛋白，已被報(bào)道參與植物光合作用等生物學(xué)過程。Seita.9G561800是擬南芥AT3G553330基因的同源基因，其編碼的類PsbP蛋白PPL1能夠在高強(qiáng)度光照下有效修復(fù)PSⅡ；是水稻LOC-Os10g32400基因的同源基因，其編碼PsbP蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，PsbP表達(dá)下調(diào)的植株葉片輕微發(fā)白，生長(zhǎng)遲緩，光合作用受到抑制。因此，結(jié)合候選基因的分析和功能注釋，wsl2應(yīng)該是谷子的一個(gè)新條紋葉突變體，初步推測(cè)其是由一個(gè)編碼類PsbP蛋白的Seita.9G561800基因發(fā)生突變所致，但還需進(jìn)一步進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。

A.突變體和野生型測(cè)序峰圖；B.緊密連鎖標(biāo)記MRI501-3電泳圖片。M.DNA Marker；1.野生型長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)；2.突變體wsl2；3-5.wsl2×野生型雜交自交F2分離群體中的部分突變表型單株；6-11.wsl2×野生型雜交自交F2分離群體中的部分正常表型單株。

3 結(jié)論與討論

3.1 MutMap在突變基因定位和克隆中的應(yīng)用

MutMap方法是Abe等[29-30]2012年提出的一種基因克隆新方法，相較于圖位克隆方法，MutMap方法克隆基因更快捷、效率更高、成本更低，該方法是以二代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，通過對(duì)F2分離群體中隱性表型個(gè)體的DNA pool的深度測(cè)序，然后把突變體群體測(cè)序結(jié)果與野生型基因組序列相比對(duì)，找出造成突變體性狀的基因。MutMap方法在快速克隆質(zhì)量性狀的隱性核基因和數(shù)量性狀的QTL定位方面均有應(yīng)用[29-30，32-34]。本研究中，以wsl2和野生型雜交自交的F2分離群體為定位群體，采用MutMap技術(shù)進(jìn)行wsl2突變基因精細(xì)定位，取30株條紋葉表型植株的葉片，同時(shí)野生型作為對(duì)照進(jìn)行基因組重測(cè)序，篩選SNP-index接近于1的區(qū)域作為與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域，在該區(qū)間中共包含9個(gè)非同義突變基因，進(jìn)一步根據(jù)基因功能注釋及表達(dá)模式分析，快速推測(cè)候選基因。

3.2 PsbP蛋白家族的功能分析

PsbP蛋白是葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ中放氧復(fù)合體的外周蛋白之一，是保證PSⅡ功能完整性不可缺少的組成部分，在光合作用中能夠利用光能氧化水產(chǎn)生氧氣[35-36]。光合系統(tǒng)相關(guān)基因的研究對(duì)葉綠體發(fā)育機(jī)制和提高植物光合效率具有重要的理論意義和研究?jī)r(jià)值[37]。

高等植物中的PsbP蛋白來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的cyanoP蛋白[35]。在高等植物中發(fā)現(xiàn)了大量的PsbP同源基因，擬南芥中有2個(gè)PsbP基因分別編碼PsbP1和PsbP2，而煙草中據(jù)報(bào)道有4個(gè)PsbP同源基因，這些基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能相對(duì)比較保守[36，38]。除此之外，高等植物中還編碼了一些與cyanoP序列同源性較高的類PsbP蛋白(PsbP-like protein，PPL)[39-40]和一些具有PsbP結(jié)構(gòu)域的PPD(PsbP-domain protein，PPD)蛋白[41]。PsbP蛋白家族含有保守的C端結(jié)構(gòu)域。利用RNAi方法不同程度地沉默煙草的4個(gè)同源基因(PsbP-RNAi)，使PsbP的表達(dá)受到抑制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PsbP的積累量影響了PSⅡ的活性。突變體在生長(zhǎng)過程中與野生型相比葉色偏白，植株生長(zhǎng)遲緩，葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂[42-43]。擬南界中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)類PsbP蛋白，PPL1(AT3G553330)能夠在高強(qiáng)度光照下有效修復(fù)PSⅡ[39]，而PPL2(AT2G39470)是葉綠體NAD(P)H脫氫酶復(fù)合體穩(wěn)定積累所必需的[40]。

本研究中，通過MutMap方法克隆到一個(gè)與葉綠體相關(guān)的類PsbP蛋白基因，Seita.9G561800是擬南芥PPL1(AT3G553330)基因的同源基因，其編碼的類PsbP蛋白PPL1能夠在高強(qiáng)度光照下有效修復(fù)PSⅡ；是水稻Os10g32400基因的同源基因，其編碼PsbP蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，PsbP表達(dá)下調(diào)的植株葉片輕微發(fā)白，生長(zhǎng)遲緩，光合作用受到抑制。因此，結(jié)合候選基因的分析和功能注釋，該編碼類PsbP蛋白的Seita.9G561800基因發(fā)生的突變可能是導(dǎo)致wsl2葉色發(fā)生突變的原因，該基因尚需進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證。