張 曦，錢玉源，劉 祎，王廣恩，宋世佳，李曉飛，米換房，崔淑芳，李俊蘭

(1．河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051；2．河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050051；3．河北工程大學(xué)，河北 邯鄲 056038；4．邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 邯鄲 056001)

棉花色素腺體(Pigment gland)又稱棉酚腺體，通常呈褐色或黑褐色點(diǎn)狀，是積累棉酚及其衍生物質(zhì)的溶生腔隙，分布于棉屬(Gossypium)植物各主要器官[1-2]。棉花種子富含蛋白質(zhì)、優(yōu)質(zhì)脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等，具有巨大的食用、保健、飼用和工業(yè)應(yīng)用潛力。但由于棉酚對單胃動物和人類有毒害作用，嚴(yán)重限制了棉籽的綜合利用[3-4]。棉酚含量通常與腺體數(shù)量正相關(guān)[5]。研究棉花色素腺體發(fā)育和棉酚代謝的調(diào)控機(jī)制，發(fā)掘和利用關(guān)鍵基因開展低酚棉分子育種，具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

NAC(NAM/ATAF/CUC)轉(zhuǎn)錄因子屬于植物特有的基因超家族，參與植物生長發(fā)育、物質(zhì)代謝、脅迫應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程[11-12]。通常NAC蛋白具有N端的DNA結(jié)合域和C端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)2個功能域，一些NAC蛋白的C端還含有跨膜基序[13]。Sun等[13]鑒定了4個棉種的NAC轉(zhuǎn)錄因子，分別為陸地棉(G.hirsutum)283個、海島棉(G.barbadense)267個、亞洲棉(G.arboreum)147個和雷蒙德氏棉(G.raimondii)149個。一些NAC轉(zhuǎn)錄因子已證實(shí)在棉花生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用。陸地棉GhXND1基因負(fù)調(diào)控植物木質(zhì)部形成，在擬南芥(Arabidopsis)中超表達(dá)GhXND1后，木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞減少，維管束間細(xì)胞的細(xì)胞壁變薄[14]。GhNAC12自棉花子葉開始衰老時(子葉展開后35 d)顯著上調(diào)表達(dá)，超表達(dá)GhNAC12引起擬南芥早衰[15]。陸地棉GhFSN1能夠正調(diào)控次生壁加厚和負(fù)調(diào)控纖維伸長[16]。棉花中超表達(dá)水稻SNAC1基因，可以促進(jìn)根系生長和降低呼吸速率，從而增強(qiáng)植株耐鹽、耐旱性[17]。海島棉GbNAC1基因正調(diào)控?cái)M南芥黃萎病抗性并參與多種非生物脅迫應(yīng)答[18]。草棉GhNAC2基因在非脅迫條件下可以促進(jìn)擬南芥和棉花生長。甘露醇和NaCl脅迫下，GhNAC2仍能促進(jìn)擬南芥根系發(fā)育；水分脅迫下可減少轉(zhuǎn)基因棉花葉片的萎蔫和脫落[19]。GhNAC79超表達(dá)植株的抗旱性得到了提高[20]。棉花中超表達(dá)GhATAF1可以增強(qiáng)耐鹽性，但也提高了棉花對黃萎病和灰霉病病菌的敏感性[21]。

河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所品種資源研究室對有腺體陸地棉品種中棉所12(以下簡稱中12)和其顯性無腺體近等基因系中棉所12顯性無腺體(以下簡稱中12顯無)幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選到1個在兩材料間顯著差異表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子Gh-D06G2096。Gh-D06G2096在中12顯無幼胚發(fā)育過程中幾乎不表達(dá)，但在中12幼胚發(fā)育至花后35 d(腺體發(fā)育后期)時顯著上調(diào)表達(dá)，表明其可能與腺體形成密切相關(guān)[22]。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了Gh-D06G2096編碼區(qū)(Coding sequence，CDS)序列，命名為GhNAC201，并對其進(jìn)行了基因序列和時空表達(dá)模式分析，為NAC轉(zhuǎn)錄因子在棉花腺體發(fā)育中的功能研究和低酚棉育種提供理論基礎(chǔ)和可利用的基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料與處理

本研究的試驗(yàn)材料有腺體棉花品種中12和顯性無腺體材料中12顯無由國家棉花種質(zhì)資源中期庫和國家棉花種質(zhì)資源平臺提供，隱性無腺體品種邯無198由邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。對3個棉花材料于種子萌發(fā)期、苗期、開花期和花后26 d分別取樣，每個樣品取2份，1份液氮速凍用于基因時空表達(dá)模式分析，1份用于觀察和計(jì)數(shù)腺體數(shù)量。種子萌發(fā)期：種子胚根伸長1 cm左右時剝殼。苗期：參照Zhang等[23]的方法種植水培苗，第2片真葉完全展開時分別取根、莖、葉、子葉。開花期：田間種植的植株取倒四葉、當(dāng)天上午盛開的花和1 cm左右的幼蕾?；ê?6 d：田間種植的植株取倒四葉和花后26 d幼胚。激素處理：光照培養(yǎng)室中種植的中12幼苗第2片真葉完全展開時分別噴施脫落酸(Abscisic acid，ABA，100 μmol/L)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA，400 μmol/L)、赤霉素(Gibberellin，GA3，150 μmol/L)和油菜素內(nèi)脂(Brassinosteroid，BR，1 μmol/L)，于處理后0，3，6 h分別取葉片，用于基因激素應(yīng)答分析。

1.2 棉花RNA提取和cDNA合成

使用RNAprep Pure Plant Kit(DP441，天根生化科技(北京)有限公司)提取樣品總RNA，并檢測其質(zhì)量。參照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(KR106，天根生化科技(北京)有限公司)說明書合成cDNA，然后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因時空表達(dá)分析

用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)GhNAC201的熒光定量PCR引物(表1)，以Histone3為內(nèi)參基因[2]。qRT-PCR使用SuperReal熒光定量試劑盒(FP205，天根生化科技(北京)有限公司)，反應(yīng)體系為20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，RNase-free ddH2O 7.8 μL。采用Bio-rad熒光定量PCR儀，反應(yīng)參數(shù)參照試劑盒說明書：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，最后進(jìn)行溶解曲線分析。每個樣品3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)中所使用的引物

1.4 基因克隆和序列分析

根據(jù)公布的TM-1(NAU-NBI_v1.1)Gh-D06G2096側(cè)翼序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)基因克隆引物。以中12 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，經(jīng)菌液PCR鑒定的單克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。利用BlastX進(jìn)行基因的同源性比對，用Mega 7.0進(jìn)行序列比對和構(gòu)建進(jìn)化樹。利用ProtParam(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)分析蛋白的理化性質(zhì)；SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白功能域；TargetP 1.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位；NetPhos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白磷酸化位點(diǎn)；SOMPA和Phyre分別預(yù)測蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)；MEME(http：//meme-suite.org)預(yù)測蛋白氨基酸序列的保守motif，并用TBtools重新繪制motif圖。

1.5 棉花色素腺體數(shù)量的統(tǒng)計(jì)與分析

體視顯微鏡(LEICA DFC550)觀察和計(jì)數(shù)不同組織樣品腺體數(shù)量，并換算成腺體密度(個/cm2)，分析棉花色素腺體的時空分布規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhNAC201基因克隆及序列分析

利用RT-PCR技術(shù)克隆了中12中Gh-D06G2096的CDS序列(圖1)，經(jīng)測序驗(yàn)證，與TM-1中參考序列(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)完全一致，參考Sun等[13]對陸地棉NAC基因的編號，命名為GhNAC201(GenBank登錄號：MN232001)。GhNAC201CDS區(qū)為948 bp，編碼315 aa。GhNAC201蛋白的分子量為36.8 ku，理論pI 5.97。SOPMA預(yù)測GhNAC201的二級結(jié)構(gòu)包括27.94%的α-螺旋，18.10%的延伸鏈，5.40%的β-轉(zhuǎn)角和48.57%的無規(guī)則卷曲。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，GhNAC201 26-190 aa序列與水稻(OryzasativaL. ssp.japonica)stress-responsive NAC1(SNAC1)蛋白序列高度匹配(100%置信度)。根據(jù)SNAC1晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測GhNAC201的三維結(jié)構(gòu)(圖2)。GhNAC201蛋白在30-163 aa存在1個NAM結(jié)構(gòu)域。用NetPhos 3.1預(yù)測潛在磷酸化位點(diǎn)，表明GhNAC201有16個絲氨酸、9個蘇氨酸和5個酪氨酸潛在修飾位點(diǎn)。其中第66，85，111，137，145 aa處的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，第106，109，110，130，139，161 aa處的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和第118，127，152，157 aa處的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)位于NAM結(jié)構(gòu)域內(nèi)(圖3)。用TargetP 1.1工具對GhNAC201的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(表2)，表明GhNAC201定位于分泌通路(0.536)和其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(0.721)的概率較高。

M.DL2000 DNA Marker；1.GhNAC201編碼區(qū)。

彩色箭頭方向?yàn)镹→C末端。模型維度(?)：X.55.229；Y.36.150；Z.46.112。

圖3 GhNAC201磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

表2 GhNAC201亞細(xì)胞定位預(yù)測

2.2 GhNAC201同源蛋白進(jìn)化及保守基序分析

將GhNAC201與棉屬及其他物種中代表性同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，棉屬不同棉種中的GhNAC201同源序列的相似度很高，且與擬南芥和油菜(Brassicanapus)同源蛋白最為相似。GhNAC201在雙子葉植物中的同源性高于單子葉植物(圖4-A)。進(jìn)一步分析GhNAC201及其同源蛋白的保守基序，可以發(fā)現(xiàn)基序1、基序2、基序3、基序4和基序7在不同物種中高度保守，GhNAC201與XP 017614396.1(G.arboreum)、XP 012452555.1(G.raimondii)基序組成模式完全一致(圖4-B)。

2.3 GhNAC201的時空表達(dá)模式與腺體密度的時空分布

GhNAC201在有腺體棉各個組織的表達(dá)均極顯著高于無腺體棉，且有腺體棉的種子、苗期根、苗期莖、苗期葉和花后26 d幼胚中GhNAC201豐度較高。2個無腺體棉材料中，GhNAC201僅在苗期根中表達(dá)量較高，在其他組織部位不表達(dá)或表達(dá)量很低(圖5-A)。在有腺體棉中12中，GhNAC201的時空表達(dá)模式與腺體密度時空分布規(guī)律趨于一致(圖5-B)，且受ABA、BR、GA和MeJA誘導(dǎo)極顯著上調(diào)表達(dá)(圖5-C)。

圖4 GhNAC201同源蛋白的進(jìn)化(A)及保守基序(B)分析

A.3個棉花材料不同組織中GhNAC201的表達(dá)模式；B.中棉所12中GhNAC201表達(dá)模式與腺體密度的關(guān)聯(lián)；C.中棉所12中GhNAC201受激素誘導(dǎo)的表達(dá)模式。不同大寫字母表示1%水平差異顯著(P<0.01)。

A.Expression patterns ofGhNAC201in different tissues of 3 cotton germplasms； B.Correlationship between gland density and expression pattern ofGhNAC201in Zhongmiansuo 12；C.Expression patterns ofGhNAC201under hormone treatment in Zhongmiansuo 12.Different capital letters are significantly different at the 1% level(P<0.01).

圖5GhNAC201的時空表達(dá)模式及與腺體密度的關(guān)聯(lián)

Fig.5 Expression patterns ofGhNAC201and its correlationship with gland density

3 結(jié)論與討論

棉酚對人畜的毒害作用限制了棉株和棉籽的綜合利用[4]。棉花色素腺體發(fā)育與棉酚的合成與代謝密切相關(guān)[2，5]，研究腺體發(fā)育及其對棉酚合成的調(diào)控機(jī)制，開展低酚棉分子育種，對于增加棉花產(chǎn)業(yè)附加值具有重要意義。

本研究克隆的GhNAC201基因在有腺體棉中的表達(dá)極顯著高于無腺體棉，且在有腺體棉中的時空表達(dá)模式與腺體密度的時空分布規(guī)律趨于一致，表明其與腺體形成存在較高相關(guān)性。棉花色素腺體是棉屬植物體內(nèi)儲藏棉酚的囊狀內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)[24]，一般認(rèn)為，棉酚及其衍生物由根尖合成，之后向植株地上部分輸送并貯藏于色素腺體內(nèi)[25]。低酚棉全株無色素腺體，但在各器官中仍能檢測到少量游離棉酚[5]。本研究克隆的GhNAC201基因，通過生物信息學(xué)手段預(yù)測其可能定位于分泌通路，且其在無腺體棉中，僅在苗期根中的表達(dá)較高，在其他組織中幾乎不表達(dá)，推測其可能直接或間接調(diào)控棉酚代謝。

NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答等生命過程[13]。對不同腺體類型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，可以檢測到NAC基因差異表達(dá)[2，26-27]。本研究室中12和中12顯無幼胚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中，NAC數(shù)量最多。澳洲野生棉和亞洲棉萌發(fā)期種子轉(zhuǎn)錄組測序也得到了類似結(jié)果，差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中，NAC數(shù)量僅次于MYB/MYB-related基因[26]。上述研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子很可能參與了棉花腺體形成或棉酚代謝。進(jìn)化樹和基序分析表明，GhNAC201及其同源蛋白在不同物種中序列相似性較高，其中有5個基序高度保守。故可以參考其他物種中同源基因的功能研究，分析GhNAC201在腺體發(fā)育或棉酚代謝中的作用。GhNAC201在擬南芥中的同源基因AT2G43000.1(又稱ANAC042、ATJUB1、NAC042等)，可能通過調(diào)控P450基因，進(jìn)而誘導(dǎo)擬南芥植保素的生物合成。但ANAC042是直接還是間接調(diào)控這些P450基因尚不明確[28]。P450也是棉酚合成的關(guān)鍵基因[29]。解析NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控P450的機(jī)制，為腺體發(fā)育及棉酚代謝提供了可參考的研究方向。擬南芥和番茄(Solanumlycopersicum)中，JUB1參與調(diào)控GA和BR代謝及信號通路[12，30]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在依賴于ABA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要作用[11]。本研究中，GhNAC201受GA、BR和ABA誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與GA、BR和ABA信號通路。在生物脅迫下，NAC基因通過茉莉酸(Jasmonic acid，JA)通路參與應(yīng)答[31]。棉花中，控制顯性無腺體性狀的基因GoPGF可能通過JA通路調(diào)控色素腺體形成及棉酚代謝[2]。GhNAC201在中12和中12顯無間差異表達(dá)，且受MeJA誘導(dǎo)，可能參與GoPGF調(diào)控的JA信號通路，影響色素腺體形成及棉酚代謝。綜上所述，GhNAC201與棉花色素腺體發(fā)育密切相關(guān)，可能通過ABA、BR、GA和JA通路調(diào)控腺體發(fā)育或棉酚代謝。