李婧慧，李淑琴，朱波，曹陽，金彥龍，喬艷清，張新宇，孫杰，薛飛*

（1.石河子大學農(nóng)學院/ 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子832003；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第五師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆雙河833408 ）

天然彩色棉是1 種在吐絮時期棉纖維便帶有綠色、棕色等顏色的棉花。 我國是世界上最大的天然彩色棉生產(chǎn)國[1-2]，新疆是世界上種植彩色棉面積最大的地區(qū)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%左右，約占國內(nèi)彩色棉總產(chǎn)量的95%[3-4]。 近年來，環(huán)境污染問題和可持續(xù)發(fā)展備受關(guān)注，未受漂白劑、染料腐蝕，綠色健康的天然彩色棉，在透氣性、吸汗性、抗靜電等方面的優(yōu)勢，受到廣大消費者的喜愛[5-6]。 市場對天然彩色棉需求量持續(xù)增加，然而一些不法商販為追求高額利潤，用白色棉冒充彩色棉，造成天然彩色棉市場魚目混珠，影響消費者切身利益，侵犯育種者品種權(quán)[7]。 因此，建立1 套可靠性高、可操作性強的品種鑒定體系，有益于保障彩色棉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

目前，構(gòu)建品種DNA 指紋數(shù)據(jù)庫的標記主要是 SSR（Simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列）和SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性）[8]。 部分主要農(nóng)作物的DNA 指紋數(shù)據(jù)庫已逐步建立標準和規(guī)范[9]，如小麥[10]、水稻[11]、玉米[12]、棉花[13]、大豆[14]、煙草[15]。 關(guān)于棉花 DNA 指紋圖譜構(gòu)建也開展了大量工作[9,16-17]，許鴻越等[18]依據(jù)農(nóng)藝性狀和SSR 分子標記對137 份陸地棉、13 份海島棉以及27 份亞洲棉等多種纖維色澤的種質(zhì)資源進行研究，發(fā)現(xiàn)3 個栽培種中天然彩色棉種質(zhì)遺傳多樣性十分豐富。 馬軒等[19]利用SSR 分子標記構(gòu)建18個彩色棉品系DNA 指紋圖譜，結(jié)果顯示，彩色棉具有相對狹窄的遺傳背景。 尤春源等[1]利用SSR 核心引物對2012 年前新疆審定的新彩棉品種構(gòu)建DNA 指紋圖譜并進行遺傳多樣性分析，區(qū)分全部品種需要18 對特異引物及組合引物。Wang 等[20]認為標記NAU3735 和標記NAU5434 分別與棕色纖維基因位點Lc1和Lc2共分離，2015 年篩選獲得2個棕色棉纖維色澤決定QTL （Quantitative trait locus，數(shù)量性狀位點） 位點 （命名為qFC15-1 和qFC15-2）[21]。 Wen 等[22]將棕色棉纖維Lc1相關(guān)的qBFA07-1 和qBFA07-2 兩個基因位點的候選基因分別確定為Gh_A07G2341 和Gh_A07G0100，基于該位點的功能標記將有助于棕色棉的分子檢測和分子育種。 為進一步完善新疆彩色棉花品種DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，推動彩棉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，本研究利用分子標記技術(shù)構(gòu)建了27 個新彩棉系列品種DNA 指紋圖譜，為彩棉分子檢測和分子育種提供實用標記和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料和SSR核心引物

以新疆審定的27 份彩色棉品種的種子為供試材料，由石河子農(nóng)業(yè)科學院、中國彩棉（集團）股份有限公司、新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所、石河子大學棉花所提供，包括新彩棉1 號至8 號，10 號至28號（表1）。 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）所用試劑及電泳試劑均購自廣州東盛生物科技有限公司。

1.2 棉花基因組DNA提取及檢測

采用改良SDS 法[23]提取各材料的種子基因組DNA。 使用ND-1000 和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量，將 DNA 稀釋至 100～200 mg·L－1。

表1 27 個新疆彩色棉品種信息

表1（續(xù)）

1.3 PCR擴增及產(chǎn)物檢測

PCR 反應(yīng)體系（20 μL）包括 10 μmol·L－1正、反向引物各 1 μL，10×Taq buffer （含有 Mg2＋）2.0 μL，2.5 mM dNTPs 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL（5×106U·L－1），模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 12.2 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃（以引物的Tm 值為依據(jù)變換）退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，循環(huán) 33 次；72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳―銀染法進行檢測[9]，上樣量為 3～5 μL，在150 V 恒壓下電泳110～130 min（根據(jù)室內(nèi)溫度和引物擴增片段大小的不同更改）。 固定、銀染、顯色后終止反應(yīng)[24]，放在凝膠觀察燈上拍照統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

依照同一引物在27 個品種基因組DNA 擴增帶型依次編號（1―10），統(tǒng)計分子標記SSR 多態(tài)性帶型和所代表的等位位點個數(shù)[25]；根據(jù)PCR 擴增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳的相對遷移位置，對條帶分布情況進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計[26]，采用“0、1”計帶方法[27]記錄，即在凝膠的同一條帶上，有帶記為1、無帶記為0，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

根據(jù)每對引物在供試材料中擴增帶型及數(shù)量的不同，計算分子標記多態(tài)性信息含量（Polymorphism information content，PIC）值，PIC=1－∑（Pi）2，其中Pi 指某一標記第i 個擴增帶型產(chǎn)生的頻率，∑（Pi）2為此標記所有多態(tài)性帶型的（Pi）2之和[26,28]。利用NTDYS 2.1 軟件中的Similarity 模塊計算品種間遺傳相似系數(shù)，采用未加權(quán)平均數(shù)（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）[9]和主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）[29]分別繪制樹狀聚類圖和二維散點圖進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性引物篩選及多態(tài)性帶型分析

根據(jù)實驗室前期篩選出的SSR 核心引物和相關(guān)文獻報道的功能標記[22]，從棉花生物信息學數(shù)據(jù)庫（http://www.cottongen.org/）和棉花功能基因組學數(shù)據(jù)庫（https://cottonfgd.org/）中查找引物序列，由華大基因科技股份有限公司合成，根據(jù)親緣關(guān)系遠近選取部分新彩系列棉花品種用于引物初步篩選，最終篩選出條帶簡單、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的52 對多態(tài)性引物（表2），對供試材料進行PCR 擴增，構(gòu)建新疆彩色棉品種指紋圖譜。

52 對多態(tài)性引物在27 份材料中擴增得到155個擴增帶型，平均每對引物2.98 個，變化范圍為2～7 個。 其中，大于平均值的多態(tài)性引物有27 個。其中，SSR225 擴增出 7 種帶型，帶型數(shù)最多 （圖1），表示該位點變異頻率最高，遺傳多樣性豐富。DPL0111 有 6 種 帶 型 ，NAU2277、W01、okra-195、DPL0757 和 HAU2786 有 5 種擴增帶型。 核心引物PIC 值介于 0.137 1～0.776 4 之間（表2），平均值為0.454 3，其中PIC 大于平均數(shù)的引物有26 個，平均值達0.557 6，引物編號依次為1―26，表明這些引物鑒別能力較強。擴增帶型數(shù)和多態(tài)性信息含量皆大于平均數(shù)的核心引物有18 對，如引物SSR225的PIC 值和多態(tài)性帶型個數(shù)分別為0.776 4 和7（表1 和圖1A），進一步證實這些分子標記具備較高的鑒別能力，適合用于新彩棉系列品種鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建、純度真實性檢測及遺傳多樣性分析等相關(guān)研究。

表2 52 對核心引物信息

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

表2 （續(xù)）

2.2 新彩系列棉花品種指紋圖譜分析

圖1 引物SSR225、W01 在27 個彩棉品種中的電泳擴增圖

采用52 對多態(tài)性引物對27 個新彩棉系列品種進行DNA 指紋圖譜分析。根據(jù)PCR 擴增產(chǎn)物的電泳條帶顯示，其中12 個新彩棉品種存在特征引物（表3）。 具有特征引物的品種，因其具有明顯區(qū)別于其他品種特有指紋信息的引物[9]，僅用特征引物即可將該品種與其他26 個新彩棉系列品種區(qū)分開。 結(jié)果顯示，新彩棉1 號、新彩棉5 號、新彩棉10號、新彩棉13 號和新彩棉17 號分別具有1 對特征引物，新彩棉7 號、新彩棉16 號、新彩棉27 號和新彩棉28 號分別具有2 對特征引物，新彩棉8 號具有3 對引物，新彩棉4 號具有5 對特征引物，新彩棉22 號具有9 對特征引物。 圖1A 為分子標記SSR225 在27 個材料中的電泳擴增圖，其多態(tài)性信息含量PIC 值為0.78，有7 種多態(tài)性帶型，可以一次性鑒別出新彩棉8 號和新彩棉22 號。 圖1B 所示是核心引物W01 電泳擴增圖，多態(tài)性帶型有5種，可鑒定出新彩棉8 號和新彩棉27 號。

其他15 份新彩棉材料無特征引物，需要使用多對引物進行鑒別，表4 給出了這15 個品種鑒定所需的最少引物組合。以鑒定新彩棉2 號為例，第一步利用分子標記NAU1167，根據(jù)PCR 擴增產(chǎn)物電泳檢測帶型結(jié)果，將新彩棉1 號、新彩棉2 號、新彩棉6 號、新彩棉 15 號、新彩棉 19 號、新彩棉 20 號、新彩棉21 號和新彩棉23 號（這8 個材料帶型一樣）從27 份材料中區(qū)分出來。 第二步使用多態(tài)性標記JESPR0251 將新彩棉1 號、新彩棉2 號和新彩棉6號鑒別出來。 第三步選用SSR 標記DPL0111 可明顯將新彩棉2 號與新彩棉1 號、新彩棉6 號區(qū)分開，可將新彩棉2 號從27 份材料中鑒別出來。根據(jù)表3和表4，將結(jié)果匯總為表5，最少選用9 對多態(tài)性引物即可完全區(qū)分27 份新彩棉系列品種。

2.3 27份彩棉品種的遺傳多樣性分析

2.3.1聚類分析。 利用NTSYS 2.1 軟件進行遺傳相似性分析，結(jié)果表明，27 個新彩棉品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.573 3～0.955 9，平均值為0.764 6，遺傳相似系數(shù)范圍較大，表明新疆彩色棉品種遺傳多樣性相對豐富。 聚類分析（圖2）顯示，遺傳相似系數(shù)約為0.611 5 時，可將27 個彩棉系列品種分為 3 類，Ⅰ類包含新彩棉 1、2、6、11、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26 和 28 號，Ⅱ類包含新彩棉 10、12、16 號，Ⅲ類包含新彩棉 3、4、5、7、8 和 27 號。 新彩棉 1 號和 6 號間的遺傳相似系數(shù)最大，說明兩者遺傳差異最小；新彩棉7 號和新彩棉20 號間的遺傳相似系數(shù)最小，說明兩者親緣關(guān)系較遠。

2.3.2主坐標分析。 應(yīng)用NTSYS 2.1 軟件對原始矩陣數(shù)據(jù)進行PCoA 分析 （主坐標分析），利用Eigen 程序繪制主坐標分析圖（圖3），供試材料聚為3 大類群，二維主坐標分析結(jié)果與樹狀聚類結(jié)果有一定差異性和一致性。 樹狀圖中Ⅰ類涵蓋群A以及群B 的3 個品種，樹狀圖Ⅱ和Ⅲ類聚為群C（缺少新彩棉4 號和10 號）?？傮w來說，兩種聚類結(jié)果相似，試驗材料具有一定的遺傳多樣性。

表3 12 個新疆彩色棉品種的特征引物

表4 鑒定另外15 個新疆彩色棉品種的最優(yōu)引物組合

表5 27 個新疆彩色棉品種的9 對核心引物十進制數(shù)字指紋代碼

2.4 新彩棉系列品種二維碼的構(gòu)建

利用分子標記技術(shù)進行棉花品種鑒定，可以彌補常規(guī)品種檢測手段的不足，作為田間鑒定的補充。 本研究為每個品種構(gòu)建專屬二維碼，掃描二維碼可以了解該品種的相關(guān)信息，二維碼生成網(wǎng)址為：http://www.liantu.com/，其中 4 個品種的二維碼見圖4。

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，綠色、天然、環(huán)保、健康已然成為了消費者對紡織品的新追求，彩色棉與紡織品綠色、健康的發(fā)展方向完全一致。 目前，關(guān)于新彩棉系列品種研究主要涉及影響纖維質(zhì)量和色澤沉著相關(guān)基因的功能分析、色澤形成機理及與其他棉種在各項指標對比等方面[30-31]，基于分子標記進行品種鑒定相關(guān)研究較少。鑒于棉花種子市場多、亂、雜問題嚴重，應(yīng)加強關(guān)于天然彩色棉種質(zhì)鑒別方面的研究。本研究利用分子標記對新彩棉品種進行鑒定，有助于新彩系列品種的分子檢測、新品種培育及棉花產(chǎn)業(yè)綠色健康可持續(xù)發(fā)展。

圖2 基于遺傳相似系數(shù)構(gòu)建的27 份新彩棉系列品種的樹狀聚類圖

圖3 27 個新彩棉系列品種的二維主坐標分析圖

圖4 部分新彩棉品種二維碼

本研究使用52 對核心引物在27 份供試材料中共擴增出155 個多態(tài)性帶型，多態(tài)性信息含量大于平均值的26 對引物中，只有4 對與已有研究報道相同[1]，鑒定篩選出的核心引物多態(tài)性高，鑒別能力強，可用于彩棉系列品種純度和真實性檢測、遺傳多樣性分析及分子育種工作。本研究并未選取均勻分布于棉花26 對染色體的多態(tài)性引物，而是更多選取與控制農(nóng)藝性狀位點連鎖的標記，不僅可用于遺傳多樣性分析，還可用于目標性狀的分子檢測。 棕色棉基因Lc1的緊密連鎖標記SSR225[22]可將其中的6 個綠色棉與20 個棕色棉區(qū)分開，將新彩棉4 號（綠色）與其他17 個棕色棉區(qū)分，但新彩棉 4 號（綠色）和新彩棉 13 號、20 號、24 號（棕色）不能區(qū)分；SSR241 和utr_0143down 均可作為新彩棉4 號的特征引物將其與其他棕色棉品種區(qū)分。Gh_A07G0100 為qBFA07-2 基因座的候選基因，可將新彩棉22 號與其他26 個品種區(qū)別，但不能區(qū)分棕色棉與綠色棉，因為qBFA07-2 基因座作用于棕色纖維顏色深淺，并未控制棕色纖維顏色沉積。

樹狀圖聚類分析顯示，除新彩棉5 號和10 號外棕色棉均聚在Ⅰ類，綠色棉和新彩棉5 號、10 號（棕色）分布在Ⅱ和Ⅲ類；二維主坐標分析顯示，群A 包含的12 個品種均為棕色棉，群B 聚集4 個棕色棉和1 個綠色棉（新彩棉4 號），群C 包含除新彩棉4 號外的所有綠色棉和1 個棕色棉（新彩棉5號）。主坐標分析與樹狀圖聚類相似，結(jié)果與纖維顏色較為一致。 總體來看，棕色棉品種相似系數(shù)比綠色棉相似系數(shù)高，表明綠色棉具有更高的遺傳多樣性。本研究中新彩棉1 號和6 號聚為一類后與新彩棉2 號聚在一起；尤春源等[1]研究中，新彩棉1 號和2 號先聚為一類，再與新彩棉6 號聚在一起；系譜關(guān)系顯示新彩棉1 號與2 號同為棕色彩棉BC-B系選所得，新彩棉6 號為新路早6 號與棕2 雜交而來，可能是因為研究選取SSR 位點及類型有所不同，但3 個品種間的遺傳相似系數(shù)是最高的，揭示了他們之間較近的親緣關(guān)系。新彩棉3 號和4 號聚為一類，系譜信息顯示均為綠色彩棉BC-G01 系選，但其相似系數(shù)較低，與尤春源等[1]研究結(jié)果一致，表明綠色棉同品系間的遺傳基礎(chǔ)較為廣泛。 新彩棉16 號是由系9 作為母本雜交育成，新彩棉20號和24 號以系9 為父本雜交育成，聚類分析顯示相對于新彩棉16 號，新彩棉20 號和24 號相似系數(shù)較高。聚類分析從一定程度上揭示了試驗材料間的親緣關(guān)系，但與品種選育系譜信息并不完全契合。利用分子標記技術(shù)對現(xiàn)有種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，合理利用現(xiàn)有種質(zhì)資源，并基于彩色棉纖維性狀控制位點連鎖標記或功能標記開展彩色棉分子標記輔助育種，提高育種效率，保證品種的真實性和純度，對天然彩色棉產(chǎn)業(yè)實現(xiàn)綠色健康、可持續(xù)發(fā)展意義深遠。

4 結(jié)論

基于52 對分子標記對27 份育成新彩棉品種進行遺傳多樣性分析，利用9 對SSR 引物構(gòu)建了這27 個品種的DNA 指紋圖譜和專屬二維碼，結(jié)果表明新疆彩色棉品種遺傳相似系數(shù)為0.568 2～0.955 9，平均值為0.761 9，品種間遺傳背景差異較大，綠色棉的遺傳多樣性比棕色棉更加豐富。