楊皓旻，肖 昀，張運海，倪健強

1中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所，江蘇省醫(yī)用光學重點實驗室，江蘇 蘇州 215163；2蘇州大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內科，江蘇 蘇州 215006

雙光子成像的基礎理論提出后，Denk等[1]將雙光子激發(fā)現(xiàn)象應用于激光共聚焦掃描顯微鏡中，提出雙光子顯微鏡。在對生物組織成像的應用中，由于雙光子成像一般使用紅外波段的激光，受到生物組織散射影響較小，能夠比傳統(tǒng)的單光子共聚焦成像探測到更深的組織結構[2-3]；同時，由于雙光子的激發(fā)效應，對焦點外組織的熒光漂白效果較小，更適于進行活體長時間熒光成像。因此，在生命科學研究以及動物模型的應用中，雙光子成像技術已有廣泛應用[4-7]。本文將介紹雙光子活體成像技術對細胞移植和治療研究中發(fā)揮的作用，并簡要探討這項技術的發(fā)展趨勢。

1 技術原理

雙光子激發(fā)熒光是一個非線性光學過程[8-9]。與一般的單光子激發(fā)熒光不同，熒光分子被雙光子激發(fā)的過程中，熒光分子要在飛秒量級時間內吸收兩個光子，才能從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，然后通過各種輻射或非輻射衰變路徑返回至基態(tài)。當熒光分子通過自發(fā)輻射返回基態(tài)時，發(fā)出熒光。由于雙光子成像采用近紅外光作為激發(fā)光，受生物組織的散射影響相對較小，因此成像深度比可見光成像更深，一般可達到1 mm[10]，對組織進行透明化處理手后成像深度可達到3 mm[11]。

雙光子成像過程中，熒光的激發(fā)只發(fā)生在焦點附近很小的區(qū)域內，從原理上達到了空間濾波效果，避免了雜散光干擾，因此實際使用中不需要傳統(tǒng)共聚焦成像結構中的針孔，更有利于收集在體成像時微弱的光信號。在活體成像中，除了通過加入外源性熒光分子對生物組織進行熒光標記[12-13]，還可以利用組織中一些固有的熒光物質產(chǎn)生的自發(fā)熒光成像，這些熒光物質也被稱為內源熒光團[14-16]。典型內源熒光團包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、卟啉類化合物等。利用雙光子激發(fā)內源熒光團，進行自發(fā)熒光成像，已經(jīng)應用于研究在體狀態(tài)下細胞的形態(tài)學以及代謝水平[17-18]。

2 應用領域

隨著轉基因熒光標記技術[19-20]與雙光子成像技術相結合，活體光學成像技術已經(jīng)廣泛應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心肌、骨髓以及抗腫瘤藥物等領域研究中。

2.1 干細胞移植用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關研究

雙光子成像已用于研究神經(jīng)元分布、環(huán)路結構等[21-24]等基礎神經(jīng)科學問題。突觸連接是形成神經(jīng)環(huán)路、實現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的基礎。利用雙光子成像技術進行在體光學成像，可以研究突觸連接及其在學習與記憶、衰老、損傷后、疾病等過程中扮演的角色。目前，由于大部分神經(jīng)連接生物學相關的基礎問題只能在動物模型中研究，有關突觸的許多問題仍有待解答，例如在成熟的功能網(wǎng)絡中人類神經(jīng)元是否經(jīng)歷重組，如何更好地模擬影響突觸連接的一系列神經(jīng)疾病等[25]。通過對人源神經(jīng)元進行在體光學成像，可以為解答這些問題發(fā)揮作用。

人胚胎干細胞（ESCs）和誘導多能干細胞（iPSCs）有望模擬人腦在發(fā)育和疾病過程中的突觸連接[26-28]。然而，由于體外培養(yǎng)的ESCs和iPSCs衍生的神經(jīng)元存活期短，神經(jīng)與突觸成熟度不夠，建立的研究模型并不完善。有學者[29-30]建立了一套研究方案，將人ESCs/iPSCs衍生的神經(jīng)元移植進入嚙齒動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。通過雙光子成像技術，觀察移植細胞進入大腦皮層的情況，以及移植2月后在紋狀體、胼胝體等部位的軸突情況（圖1），確認該方法可以增強人神經(jīng)元的存活期和功能成熟度，更有利于開展人ESCs/iPSCs衍生神經(jīng)元在突觸形成與功能整合進入宿主的神經(jīng)網(wǎng)絡方面的研究。這套研究方法建立了更準確的大腦皮質疾病和修復模型，能夠促進細胞移植治療腦損傷等疾病的發(fā)展。

在通過移植iPSCs恢復神經(jīng)系統(tǒng)功能方面，研究表明，移植iPSCs衍生的神經(jīng)元可以促進損傷的神經(jīng)環(huán)路功能恢復[31-32]。Falkner等[32]切除了成年鼠的一部分初級視皮層，然后將鼠胚胎神經(jīng)元移植到相同區(qū)域。利用雙光子成像技術進行刺激-誘發(fā)響應的在體成像，發(fā)現(xiàn)移植神經(jīng)元響應視覺刺激的方式與宿主神經(jīng)元一致，說明它已經(jīng)完全整合進入了宿主的視覺通路，但整合的具體機制仍有待研究。

2.2 心肌細胞移植的功能研究

圖1 人ESC移植到新生小鼠腦部2月后不同腦部區(qū)域的軸突雙光子圖像Fig.1 Axonal two-photon images of different brain regions of newborn mice after human ESC transplantation

心血管疾病是人類主要的致死性疾病，應對策略主要是改變生活方式預防、藥物治療和手術干預。在心力衰竭的情況下，需要建立新的方法改善診斷和治療策略。心肌損失會導致心力衰竭，而移植是終末期心力衰竭的唯一具有確定長期療效的治療方法。但是，器官移植會帶來一系列后續(xù)問題。干細胞療法通過心肌細胞再生減少心臟變性，被認為是最有前景的治療策略之一[33]。對單個離體心肌細胞的研究已在細胞和分子水平上提供了有關電特性和鈣離子的重要信息。但是，與單個細胞相比，完整組織中心肌細胞動作電位的特性有所不同[34]。有鑒于此，在心肌細胞移植治療的研究中，原位觀察和評估移植后細胞功能恢復情況，是評價移植治療效果的重要手段。

為了評估移植心肌細胞功能整合的程度，Rubart等[35-37]開展了一系列研究，將表達EGFP的轉基因胚胎心肌細胞移植進入非轉基因成年小鼠中，結合鈣離子熒光指示劑rhod-2，對完整心臟中移植細胞和宿主細胞內鈣離子信號的瞬時變化進行雙光子成像。發(fā)現(xiàn)移植細胞與宿主細胞功能發(fā)生耦合，移植細胞可以與宿主心肌形成功能合胞體[35]。有研究還進行了心肌細胞移植治療后的功能研究[36]（圖2）。通過雙光子成像，監(jiān)測單個心肌細胞動作電位誘發(fā)鈣離子瞬時變化，并在連續(xù)電刺激的同時，通過線掃描模式下記錄rhod-2的瞬時變化，分辨了鈣離子變化的時間進程。這些研究為細胞移植后影響整體細胞功能原因的進一步研究提供了幫助。

利用雙光子顯微鏡在跳動心臟中進行細胞水平的研究，不可避免地會受到跳動引起的位移干擾，Jones等[38]在經(jīng)典雙光子顯微鏡上進行了改進，消除了血流和心臟跳動的影響，同時測量了鈣離子瞬態(tài)變化、血管尺寸和組織位移量，加以擴展后可用于現(xiàn)有研究模型中。

2.3 造血干細胞的相關研究

造血干細胞是骨髓微環(huán)境的重要組成，借助雙光子成像技術對其動態(tài)觀察，造血干細胞之間的相互作用以及對微環(huán)境的影響已有研究[39-41]。有研究利用雙光子在體成像技術，使用了GFP、DiD、自發(fā)熒光和二次諧波4種信號通道，標記識別了鼠顱骨中的幾種成分[41]（圖3）。并對其進行了多點延時成像，對造血干細胞和HSPCs進行監(jiān)測，獲得了HSPCs與周圍環(huán)境的三維圖像，對單個移植細胞實現(xiàn)了識別和長時間高精度監(jiān)測，追蹤了移植HSPCs在鼠顱骨骨髓中的遷移，并觀察了HSPCs與基質細胞的相互作用。

圖2 完整心臟中心肌細胞移植后的雙光子圖像Fig.2 Two-photon images of intact central cardiac muscle cells after transplantation

圖3 對顱骨不同深度下的二維雙光子圖像Fig.3 Two-dimensional two-photon images of the skull at different depths

采用類似的裝置，有研究在小鼠模型中，利用雙光子顯微鏡研究了急性粒細胞白血病細胞對骨髓血管和造血干細胞的影響[42]。觀察到急性粒細胞白血病中的骨髓血管受損、內膜血管丟失等現(xiàn)象，以及用小分子去鐵胺或遺傳方法，可以保存骨膜內皮，挽回造血干細胞的丟失，提高化療療效，并提高生存率。這些發(fā)現(xiàn)有可能改進現(xiàn)有治療急性粒細胞白血病的方法。

2.4 抗腫瘤藥物的療效評價

在抗腫瘤藥物的研究中，通常將腫瘤細胞移植到健康小鼠體內，建立異種移植模型。利用雙光子成像技術等在體成像技術，可觀察對抗腫瘤藥物治療后的腫瘤演變，進行藥效評價[43-45]。有研究分別使用雙光子顯微鏡實時觀察了不同腫瘤在化療藥物使用后的變化[44-45]。Shimura等[44]研究了紫杉醇在胃癌腹膜轉移性異種移植模型中的療效（圖4）。將表達紅色熒光的胃癌細胞（NUGC4）移植進入綠色熒光小鼠的腹腔，治療后，通過雙光子成像觀察，與解剖病理觀察結果對比發(fā)現(xiàn)根據(jù)二者圖像得到的結論一致。研究結果證明了該實驗方法可用于抗胃癌藥物臨床前的藥效評價，并可將個體差異降至最低。

圖4 紫杉醇治療后的腫瘤細胞雙光子圖像Fig.4 Two-photon image of tumor cells treated with paclitaxel

3 總結與展望

在已經(jīng)開展的研究中，雙光子成像技術以其較大的成像深度、較高的成像質量等特點，滿足了在體成像的需求，在以動物為研究對象的研究中發(fā)揮了重要的作用，使我們對活細胞生理、病理和藥理領域的認識得到極大的發(fā)展。但是本技術還存在一定局限：成像深度仍在毫米量級；自發(fā)熒光成像對應基團有限；非熒光標記的二次諧波成像局限于特定蛋白結構；光源功率較高，盡管光漂白效果相對較弱，焦點附近樣品仍可能受到熱損傷。通過開發(fā)新型標記材料與方法，實現(xiàn)更低漂白效果和更豐富標記手段；與其它影像技術結合，跨尺度成像，實現(xiàn)形態(tài)結構判斷與功能成像的結合，可能是本技術下一步的發(fā)展方向。