文少卿 俞雪兒 孫 暢 陳愛東 楊苗苗 袁 靖

（1.復(fù)旦大學(xué)科技考古研究院；2.復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室；3.陜西省考古研究院）

關(guān)于秦漢時期雍地舉行祭天的禮儀，在文獻(xiàn)中均有記載，但是關(guān)于祭祀用牲卻很簡略。這些馬匹是集中豢養(yǎng)專門用于祭祀，還是從全國各地按照一定的標(biāo)準(zhǔn)挑選后用于祭祀呢？通過古 DNA 高通量測序檢測，我們將探討殉馬坑內(nèi)馬的來源；同時，利用基因型和表型間的關(guān)聯(lián)性，推斷殉馬的一些體質(zhì)特征，如馬的性別、毛色、運動能力、步態(tài)等。該項研究將為探討秦漢禮制及歷史等提供參考。

一、材料與方法

1.樣本采集和提取

本次測試樣本源自血池遺址南部的北斗坊地點的7 號長條坑（K7），共有26 個馬骨樣本。DNA 提取工作在復(fù)旦大學(xué)現(xiàn)代人類學(xué)專業(yè)古DNA 實驗室進(jìn)行，遵循標(biāo)準(zhǔn)流程[1]。為最大程度地防止了實驗操作帶來的污染，我們采用了最新的短片段提取方案[2]。

2.文庫構(gòu)建與測序

為了更加符合高度降解DNA 的特性，我們設(shè)計了更為敏感的短擴(kuò)增子引物系統(tǒng)：其中線粒體擴(kuò)增子為113～126 bp，SNP 均小于105 bp。具體包括2 個高通量檢測Panel（表一）：Panel 1（母系線粒體DNA 和性別鑒定），基于該Panel，我們同時測試馬DNA 的控制區(qū)（15469-16083; 615 bp）和細(xì)胞色素b（14215-14549；335 bp），實現(xiàn)了樣本母系遺傳譜系的確定，以及2 個性別基因（SRY 和AMEL）的測試，鑒定性別。Panel 2（馬的生理和體質(zhì)特征），主要檢測5 個方面的相關(guān)基因，即毛色、運動能力、步態(tài)、身體大小/馬肩隆高度和高原適應(yīng)。

多重PCR 擴(kuò)增靶向捕獲實驗的流程包括：靶區(qū)域擴(kuò)增、PCR 產(chǎn)物純化、第二輪PCR和PCR 產(chǎn)物回收。復(fù)合擴(kuò)增以后，我們通過Agilent 2100 Bioanalyzer 對DNA 文庫進(jìn)行質(zhì)檢，觀察接頭自連、外援DNA 污染等情況，并對PCR 產(chǎn)物混樣測序。

3.數(shù)據(jù)分析

采用Illumina X10 平臺進(jìn)行雙端測序（paired-end sequencing），獲取讀長為150bp 的測序數(shù)據(jù)（fastq）。首先通過cutadapt 軟件去除接頭序列，然后用bwa（version 1.7，參數(shù)：mem）將reads 與馬參考基因組（Equus caballus 2.0，線粒體參考基因組替換為X79547 序列）進(jìn)行比對，生成BAM（Binary Alignment/Map）文件。利用samtools 及bcftools 對常染色體目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行基因位點分型檢測。對于線粒體和性染色體，我們采用bedtools 從上一步的BAM 文件提取出成功比對到馬全基因組的所有reads，再將這些reads 采用bowtie2 軟件參考X79547 序列和X、Y 染色體參考序列重新比對，生成新的BAM。對于第二步的BAM 文件，我們應(yīng)用BAMClipper軟件，根據(jù)引物物理位置從BAM 文件去除引物序列得到最終BAM 文件。最 后，采 用samtools（version 1.8） 和bcftools（version 1.8）分別對線粒體、X和Y 染色體目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行變異位點的識別，生成VCF（Variant Call Format）文件。

表一 高通量測序Panel 的基本信息

二、結(jié)果

1.線粒體DNA 世系鑒定

7 號坑的26 個樣本全部獲取了DNA 控制區(qū)（15469-16083; 615 bp）序列。以 X79547 作為參考序列進(jìn)行比對。共檢測出50 個多態(tài)性位點，48 個位點為轉(zhuǎn)換，2 個位點（15670C、16063C）為插入，沒有顛換與缺失。此外，這26 個樣本中檢測出了26 個單倍型，顯示出極高的遺傳多態(tài)性。

根據(jù)Jansen 等[3]的關(guān)于單倍型類群的劃分，26 個單倍型可以歸屬于6個不同的譜系A(chǔ)～F，進(jìn)一步可劃分到11 個不同的單倍群，分別為A1（4 匹）、A3（1 匹）、A4（1 匹）、A6（1 匹）、B1（2匹）、B2（2 匹）、C2（3 匹）、D2（2 匹）、E（2匹）、F1（3 匹）、F2（5 匹）。

表二 馬的毛色基因型與表型特征

2.性別鑒定

根據(jù)mapping 在AMEL 和SRY 上reads 的情況，七號坑中公馬共計16 匹，母馬10 匹，性別比為8:5。

3.體質(zhì)特征相關(guān)位點檢測

(1)毛色

馬的毛色分為基礎(chǔ)毛色、淡化毛色以及白斑/褪色三大類型?；A(chǔ)毛色在馬群中比較普遍，可分為騮色、褐騮色、栗色和黑色。一些修飾基因獨立或共同發(fā)揮作用形成了馬的淡化毛色，包括奶酪色、珍珠色、香檳色、銀色和暗褐色，以及調(diào)控形成更為特殊的毛色表型，如白斑、褪色等，包括分背花色、越背花色、沙邊毛色、豹點色等[4]。26 個樣本的分型結(jié)果為15 個栗色、2 個騮色、1 個黑色、4 個騮色或黑色、1 個騮銀色、1 個騮色或黑色帶豹點、1個栗色帶越背花和1 個騮色帶豹點（表二）。

(2)運動能力

對于賽馬的全基因組掃描發(fā)現(xiàn)，RALGAPA2 基因（chr22:4632335）上攜帶等位基因G 的馬有著更強(qiáng)的運動能力[5]，MSTN 基因上位點（chr18:66493737）與最佳賽距相關(guān)，攜帶C/C 基因型的馬適合快速、短距離的比賽，C/T 基因型的馬在中距離比賽中表現(xiàn)良好，T/T基因型的馬耐力更強(qiáng)，更適合長距離奔跑[6]。綜合上述位點的分型結(jié)果，七號坑26 個樣本中除了D11721 和D11723 擅長中距離跑外，其余樣本均為T/T 基因型，擅長長距離跑，耐力持久(表三)。

(3)步法

馬的行走方式受到了多次人工選擇，特別是其交替步法。SNP 位點（chr23:22967656）與馬的步態(tài)差異有關(guān)，DMRT3 基因上的一個突變（chr23:22999655）會顯著影響馬在完成交替步態(tài)時的能力[7]。隨后，該突變在全世界的不同馬種中進(jìn)行了驗證[8]。在芬恩馬（Finn horses）中，攜帶純合突變型A/A 的馬有著更好的比賽成績，而攜帶C 等位基因的馬似乎更適合古典騎術(shù)比賽[9]。綜合位點的分型結(jié)果，K7 的26 個樣本均攜帶DMRT3 基因野生型，不太擅長交替步法。

(4)身體大小/馬肩隆高度

身高是馬最容易觀察到的一個表型之一。全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，位點LCORL（chr3:105547002）、HMGA2 （chr6:81481064）、Z F A T（c h r 9:7 5 5 5 0 0 5 9） 和 L A S P 1（chr11:23259732）聯(lián)用可以解釋高達(dá)85%馬的體型差異[10]。其中，LCORL （chr3:105547002）位點可以解釋18% 的變異[11]。此外，突變（HMGA2:c.83G>A）在矮馬中常見，而在正常大小的馬的品種中沒有發(fā)現(xiàn)[12]。綜合上述位點的分型結(jié)果，七號坑26 個樣本非小矮馬，除了D11701、D11723 和D11725 身高中等外，其余都偏小，為小型馬。

(5)高原適應(yīng)

生活在高海拔地區(qū)會承受生理和代謝方面的挑戰(zhàn)，例如缺氧、低溫、高輻射和缺乏食物等。Sher L Hendrickson 通過對比低地馬和安第斯山馬的基因組，發(fā)現(xiàn)EPAS1 內(nèi)含子上的一個SNP位點（rs69 041973；chr15:52570648）與馬的高海拔適應(yīng)相關(guān)[13]。七號坑26 個樣本中D11706、D11720 和D11725 三個樣本為突變型CC，他們可能更能適應(yīng)高原低氧環(huán)境。

表三 馬的表型特征相關(guān)SNP 分型結(jié)果及其表型推測

三、討論

本次研究的材料為幼馬，無法觀察一些體質(zhì)測量和觀察類性狀，我們試圖通過與現(xiàn)代馬和古代馬的數(shù)據(jù)相比較，嘗試回答血池遺址中祭馬來源和是否有嚴(yán)格的挑選標(biāo)準(zhǔn)等問題。

1.祭馬來源

為了便于整合已發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)，本文沿用了Jansen 等[14]在線粒體DNA 單倍群的命名原則。本次檢測的26 個樣本的母系單倍型完全不同，分屬6 個大單倍群（A、B、C、D、E、F）和11 個亞單倍群。

如表四所示，古代家馬中[15-21]，最常見的世系A(chǔ)（36%），其次依次為世系F（22.5%）、世系E（14.6%）、世系B（9.0%）、世系C（7.9%）和D（6.7%）、世系G（3.4%）。北斗坊七號坑中情況類似，最高頻的也是世系A(chǔ)（26.9%）和世系F（30.8%）。如果僅考慮控制區(qū)（15494-15740），七號坑的單倍群檢出率最高（6/7），單倍型多樣性為0.9938±0.0126，說明該遺址的母系來源多樣，可能是從各地征集而來。共享單倍型分析同樣顯示了北斗坊七號坑中葬馬在個體水平上的來源多樣性。7 號坑中馬的多個單倍型分別與位于不同地域的遺址中出土的馬的單倍型完全一致（表五）：樣本D11701、D11702、D11704 顯示了與西北地區(qū)本地馬之間的密切關(guān)系；樣本D11707、D11711、D11722、D11719、D11725 顯示了與蒙古草原馬之間的密切關(guān)系；樣本D11724 顯示了與西域馬之間的密切關(guān)系。

考慮到樣本量過少帶來的統(tǒng)計學(xué)偏差，我們?nèi)サ袅藰颖緮?shù)少于3 個的遺址，并根據(jù)線粒體單倍群頻率，做了主成分分析。如圖一所示，現(xiàn)代馬按照地理分組很好地聚集在了一起。關(guān)山馬、韓國濟(jì)州馬、蒙古馬、圖瓦馬和藏馬形成了東亞馬的聚類，血池北斗坊7 號坑的古馬樣本也位于這個聚類之中，并與韓國濟(jì)州馬、蒙古馬更近一些。蔡大偉等發(fā)現(xiàn)秦公一號大墓出土的古馬疑似與阿哈爾捷金馬（汗血馬）有關(guān)[22]，在主成分分析圖上也得以體現(xiàn)，秦公一號大墓車馬坑和板城墓地的古馬樣本位于阿拉伯馬、奧爾洛夫馬和阿哈爾捷金馬組成的中亞組聚類中。其他古代遺址的樣本量均小于5，有較強(qiáng)的統(tǒng)計學(xué)偏差，主成分分析的結(jié)果不能完全真實地反映其遺傳來源。

表四 已檢測古代家馬的線粒體世系頻率分布

表五 北斗坊七號坑樣本在中國古代家馬中的共享序列分布

2.馬的表型特征

(1)性別和毛色

祭祀用馬的性別對于理解馬在儀式中的含義、馬與人的關(guān)系、以及古代社會中馬的地位和用途至關(guān)重要[23]。在已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)中，祭祀用馬一般會有意識地選擇使用公馬，例如，新疆喀拉蘇高等級墓地[24]、新疆石人子溝與西溝遺址[25]、秦始皇帝陵[26]等。本次研究發(fā)現(xiàn)血池北斗坊7 號坑的雄雌比為8:5，母馬占有較高的比例，其背后蘊含的歷史信息值得深思。另外，血池北斗坊7 號坑中出土葬馬的毛色以栗色為主，其次為騮色，還有別的顏色，當(dāng)時對于同一坑中馬匹的毛色似乎沒有嚴(yán)格地限定。

(2)運動能力/步態(tài)/肩高

中國古代的各個朝代都在有意識地培育身材高大、爆發(fā)力強(qiáng)、步態(tài)靈活的馬種。為了適應(yīng)長途騎乘，減少馬背顛簸之苦，古人對驛馬進(jìn)行了選擇，馴化可以走交替步法（溜蹄步）的馬種，讓騎馬人感覺到舒適[27]，例如，祁連山南北草原的大通馬中，有大量天生會走這種步法的馬；而東漢時期創(chuàng)作的“踏飛燕銅奔馬”正是這種輕盈步態(tài)的反映。基于基因型和表型的關(guān)聯(lián)性，血池北斗坊7 號坑中葬馬的個體較小、不擅長交替步法、擅長長距離跑，似乎不能算嚴(yán)格意義上的良駒。

圖一 北斗坊7 號坑與其他現(xiàn)代和古代家馬的主成分散點圖

四、結(jié)論

我們通過對陜西省雍山血池秦漢祭祀遺址北斗坊7 號坑中26 匹幼馬馬骨的古DNA分析，主要有兩點認(rèn)識：1.其母系來源的多樣性極高，當(dāng)時馬匹的來源地可能不止一處，根據(jù)現(xiàn)代馬和古代馬的線粒體DNA 世系頻率的主成分分析，血池北斗坊7號坑的樣本更接近于現(xiàn)代的蒙古馬，少數(shù)馬的來源可能跟高海拔地區(qū)的馬種有關(guān)。2.馬匹中雄性略多、栗色馬占大多數(shù)，當(dāng)時對祭祀用馬的性別、毛色的要求并不嚴(yán)格；這些馬雖然耐力較好，但爆發(fā)力和步法靈活度一般，不太可能成長為出色的戰(zhàn)馬。這些認(rèn)識為探討當(dāng)時祭祀用馬的征集方式、選馬標(biāo)準(zhǔn)等積累了重要的資料。今后我們還將繼續(xù)對血池遺址其他祭祀坑中的用牲開展DNA 研究，在系列研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，努力破解歷史長河中湮滅的千古之謎。

[1]Knapp M,Clarke A C,Horsburgh K A,et al.Setting the stage -building and working in an ancient DNA laboratory.[J].Annals of Anatomy,2012,194(1):3-6.

[2]Rohland N,Glocke I,Aximu-Petri A,et al.Extraction of highly degraded DNA from ancient bones,teeth and sediments for high-throughput sequencing [J].Nature Protocols,2018.

[3]Jansen,T.Mitochondrial DNA and the origins of the domestic horse [J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(16):10905-10910.

[4]趙若陽,趙一萍,李蓓,等.馬毛色遺傳機(jī)理研究進(jìn)展[J].遺傳,2018(05):21-32.

[5]Moon S,Lee J W,Shin D H,et al.A Genome-wide Scan for Selective Sweeps in Racing Horses [J].Asian Australasian Journal of Animal Sciences,2015,28(11):1525-1531.

[6]Hill E W,Jingjing G,Eivers S S,et al.A Sequence Polymorphism in MSTN Predicts Sprinting Ability and Racing Stamina in Thoroughbred Horses [J].PLoS ONE,2010,5(1):e8645.

[7]Andersson L S,Larhammar M,Memic F,et al.Mutations in DMRT3 affect locomotion in horses and spinal circuit function in mice [J].Nature,2012,488(7413):642-646.

[8]M Promerová,Andersson L S,Juras R,et al.Worldwide frequency distribution of the ‘Gait keeper’ mutation in the DMRT3 gene [J].Animal Genetics,2014,45(2):274-282.

[9]Fegraeus K J,Johansson L,M?enp?? M,et al.Different DMRT3 genotypes are best adapted for harness racing and riding in finnhorses [J].Journal of Heredity,2015,106(6):734-740.

[10]Makvandi-Nejad S,Hoffman G E,Allen J J,et al.Four Loci Explain 83% of Size Variation in the Horse [J].PLOS ONE,2012,7(7):e39929.

[11]Petersen J L,Mickelson J R,Rendahl A K,et al.Genome-Wide Analysis Reveals Selection for Important Traits in Domestic Horse Breeds [J].PLoS Genetics,2013,9(1):e1003211.

[12]Frischknecht M,Jagannathan V,Plattet P,et al.A Non-Synonymous HMGA2 Variant Decreases Height in Shetland Ponies and Other Small Horses [J].PLOS ONE,2015,10(10):1-11.

[13]Hendrickson S L.A genome wide study of genetic adaptation to high altitude in feral Andean Horses of the páramo [J].BMC Evolutionary Biology,2013,13(1):273-273.

[14]同[3].

[15]Cai D,Tang Z,Han L,et al.Ancient DNA provides new insights into the origin of the Chinese domestic horse [J].Journal of Archaeological Science,2009,36(3):835-842.

[16]蔡大偉,韓璐,朱泓.內(nèi)蒙古赤峰地區(qū)青銅時代古馬線粒體 DNA 分析[J].自然科學(xué)進(jìn)展,2007(3).

[17]趙欣,李悅,陳洪海,等.陜西省淳化縣棗樹溝腦遺址馬坑出土馬骨的DNA 初步研究[J].南方文物,2015(3).

[18]趙欣,Rodrigues A T,尤悅,等.新疆石人子溝遺址出土家馬的DNA 研究[J].第四紀(jì)研究,2014(1):187-195.

[19]趙欣,東曉玲,韓雨等.新疆木壘縣平頂山墓群出土馬骨的DNA 研究[J].南方文物,2017(3).

[20]蔡大偉,朱司祺,胡松梅,等.陜西鳳翔秦公一號大墓車馬坑馬骨遺骸古DNA 研究[J].考古與文物,2018(3):106-112.

[21]Michael C,Melanie P,Norbert B,et al.Origin and History of Mitochondrial DNA Lineages in Domestic Horses [J].PLoS ONE,2010,5(12):e15311.

[22]同[20].

[23]Ruscillo D.Zooarchaeology:methods of collecting age and sex data [C]// In:Smith,C.(Ed.),Encyclopedia of Global Archaeology.Springer New York,New York,NY,2014.

[24]尤悅,于建軍,陳相龍,等.早期鐵器時代游牧人群用馬策略初探—以新疆喀拉蘇墓地M15 隨葬馬匹的動物考古學(xué)研究為例[J].西域研究,2017(04):108-120.

[25]李悅,尤悅,劉一婷,等.新疆石人子溝與西溝遺址出土馬骨脊椎異?，F(xiàn)象研究[J].考古,2016(1):108-120.

[26]陜西省考古研究所,秦始皇兵馬俑博物館.秦始皇帝陵園考古報告（2000）[M].北京:文物出版社,2006.

[27]甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué).養(yǎng)馬學(xué)[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1990.