阮加里 朱 丹 李陽陽 Kwak-Kim Joanne 鮑時華

(同濟大學附屬第一婦嬰保健院生殖免疫科，上海 201204)

臨床上習慣將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)和反復(fù)種植失敗(recurrent implantation failure，RIF)統(tǒng)稱為反復(fù)妊娠失敗(recurrent reproductive failure,RRF)[1]，盡管目前尚沒有特別針對RRF的規(guī)范化診療指南或?qū)＜夜沧R，但普遍認為適用于RSA的病因篩查和治療策略可能同樣也適用于RRF。引起RSA的病因有染色體異常、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素等[2]，但在常規(guī)病因篩查后，仍有近50%的患者病因不明[3,4]，近年來的研究認為免疫異常及血栓前狀態(tài)可能為其潛在病因[5]。

血栓前狀態(tài)(prethrombotic state,PTS) 或稱之為易栓癥，分遺傳性和獲得性兩類，有時兩者可同時存在?？沽字C合征(antiphospholipid syndrome,APS)作為獲得性易栓癥中最常見的一種，可加重妊娠高凝狀態(tài),增加胎盤多發(fā)性小血栓形成、蛻膜血管纖維素樣壞死、胎盤血流低灌注發(fā)生的概率，從而導(dǎo)致胎盤形成或胚胎著床失敗，最終造成妊娠失敗[6,7]。而遺傳性易栓癥(inherited thrombophilia,IT)是指由于抗凝蛋白缺乏、凝血因子缺乏、纖溶蛋白缺陷或代謝缺陷所引起的易發(fā)生血栓的一類疾病，相關(guān)研究顯示在半數(shù)以上的反復(fù)種植失敗患者的血液中可檢測到至少一種IT表型[8]。胚胎對于母體來說是半同種異體移植物，正常妊娠是一種成功的半同種異體移植現(xiàn)象，母體免疫系統(tǒng)能否識別并耐受胚胎抗原，將直接影響妊娠的建立與維持，而母-胎界面則是妊娠建立和維持的關(guān)鍵部位[9]。其中自然殺傷細胞(natural killer cell，NK) 在妊娠免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，外周血NK細胞(peripheral NK,pNK)有較強的殺傷活性，具有良好的抗病毒和抗腫瘤活性，而子宮NK(uterine NK,uNK)細胞分泌細胞因子，尤其是血管生成因子，在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞侵襲和血管生成中扮演了重要的角色[10]。

易栓癥與免疫之間的聯(lián)系尚待進一步研究揭示，目前相關(guān)的文獻報道較少，本課題組在多年的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)易栓癥和NK細胞異常兩者高度相關(guān)，且近來的一些研究也顯示RSA合并APS的患者較RSA患者有著更高的NK細胞水平[11]，因此我們猜測易栓因素可能與免疫因素有著潛在關(guān)聯(lián)，鑒于目前缺乏針對遺傳性易栓癥患者群體的相關(guān)研究，本研究旨在通過回顧性分析178例反復(fù)妊娠失敗合并遺傳性易栓癥患者的臨床資料，探討外周血NK細胞數(shù)量及殺傷活性與患者再次妊娠結(jié)局的關(guān)系。這將加深我們對此類疾病的認識，并對此類患者的病因篩查及后續(xù)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1研究對象 采用回顧性隊列研究設(shè)計，納入2009年1月至2013年12月期間在Reproductive Medicine,Department of Obstetrics and Gynecology,Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science就診的未孕反復(fù)妊娠失敗患者，包括RSA和RIF。在該中心，反復(fù)妊娠失敗患者均接受包括解剖因素(如宮腔黏連、子宮畸形、子宮內(nèi)膜息肉等)、內(nèi)分泌因素(如胰島素抵抗、甲狀腺功能減退、高泌乳素血癥、糖尿病、高雄激素血癥等)、免疫因素以及血栓前狀態(tài)(包括獲得性和遺傳性易栓癥)在內(nèi)的常規(guī)篩查，篩選出其中合并有遺傳性易栓癥的患者作為本次研究的研究對象，記錄患者孕前和孕期各類影像學和實驗室檢測檢查結(jié)果、用藥情況以及妊娠結(jié)局等信息。納入標準：①25歲至45歲女性；②診斷為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者(連續(xù)在妊娠20周以內(nèi)發(fā)生2次及2次以上自然流產(chǎn))和/或診斷為反復(fù)種植失敗患者(移植≥3次優(yōu)質(zhì)胚胎或多次移植胚胎數(shù)量總計≥10枚而仍未能獲得臨床妊娠者)；③患有遺傳性易栓癥，即常見篩查項目見表1。主要排除標準：①夫婦染色體異常；②排卵障礙及月經(jīng)不規(guī)則；③抗凝藥物過敏；④子宮因素，如子宮畸形、肌瘤、息肉和宮腔黏連等；⑤自身免疫性疾病。本研究經(jīng)Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science倫理委員會審核批準，患者均簽有知情同意書。

1.2方法

1.2.1子宮生物物理評分 通過超聲檢查測量子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜線、子宮內(nèi)膜蠕動波、子宮肌層回聲、子宮動脈血流、內(nèi)膜血流以及肌層血流，最終計算子宮生物物理評分[12]。

1.2.2pNK細胞百分數(shù)的測定 分別在孕前及孕期每2周采集患者肘靜脈血于EDTA-K2 2.0 mg/ml抗凝管備測。將分離得到的PBMCs用PBS洗滌2次，取100 μl的PBMCs加入含1%胎牛血清和0.09%(w/v)疊氮鈉的PBS緩沖液(染色緩沖液)洗滌2次后加入CD3-FITC、CD45-Percip和CD16/CE56-PE(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)進行染色，加入250 μl Cytofix/Cytoperm細胞固定/通透液進行固定和通透后，使用BD公司的FASC Calibur流式細胞儀進行免疫熒光及四色流式細胞分析。

1.2.3pNK細胞殺傷活性的測定 分別在孕前及孕期每兩周采集患者肘靜脈血于EDTA-K2 2.0 mg/ml抗凝管備測。將對數(shù)期的K562與處理好的PBMCs以50∶1的比例混合，在37℃，5%CO2的條件下孵育2 h，在檢測前15 min加入100 μl碘化丙啶標記死亡細胞，同樣使用BD流式細胞儀進行檢測與分析，通過計算K562細胞的死亡率來檢測NK細胞對K562細胞的殺傷作用，從而反映NK細胞殺傷活性。

2 結(jié)果

2.1患者一般情況 回顧性分析2009年1月至2013年12月在Department of Obstetrics and Gyneco-logy,Chicago Medical School at Rosalind Franklin University of Medicine and Science就診的178例RPF合并遺傳性易栓癥患者的臨床資料，其中141例為RSA患者，37例為RIF患者。研究對象平均年齡為35.22歲，平均BMI指數(shù)為25.15 kg/m2，具體遺傳性易栓癥表型見表1。其中76.40%的患者MTHFR基因多態(tài)性呈現(xiàn)雜合或純合突變，68.36%的患者PAI-Ⅰ基因多態(tài)性呈現(xiàn)雜合或純合突變，而Factor-Ⅱ基因突變率最低僅1例(0.56%)。在本研究中外周血NK細胞百分數(shù)增高的陽性率為22.48%，NK細胞殺傷活性增高的比例為50.56%。所有納入研究的患者均在孕前(RSA患者于排卵期，RIF患者于移植前1周)及孕后(確認妊娠后)接受強的松(5 mg qd po)和/或靜脈注射免疫球蛋白G[體重×(250～300)mg/kg ivgtt q2w，2～3次]以及抗凝(低分子肝素5 000 U qd IH和小劑量阿司匹林81 mg qd po)治療。

2.2外周血NK細胞百分數(shù)及殺傷活性在孕前及孕期的動態(tài)變化 根據(jù)再次妊娠結(jié)局的不同，研究對象被分為流產(chǎn)組和活產(chǎn)組。圖1A和B分別為pNK%及pNK殺傷活性在孕前及孕期各周的分布圖。相同時期，流產(chǎn)組pNK%及NK細胞殺傷活性均高于活產(chǎn)組，其中孕前及孕6周時，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.04，P=0.03；P=0.02，P=0.04)。

表1 患者一般資料

Tab.1 Basic characteristics

2.3外周血NK細胞百分數(shù)與殺傷活性之間的關(guān)系 外周血NK細胞百分數(shù)與NK細胞殺傷活性分別從數(shù)量和生物活性兩方面反映NK細胞狀態(tài)，兩者之間有無相關(guān)性或共線性， 需要分析驗證。經(jīng)相關(guān)性檢驗(圖2A、B)，孕前及孕6周NK細胞百分數(shù)與NK細胞殺傷活性之間存在一定的正相關(guān)(r=0.37，95% CI 0.23～0.49，P=0.000 1；r=0.24，95%CI 0.05～0.40，P=0.01)。而共線性分析顯示孕前及孕后NK細胞百分數(shù)與NK細胞殺傷毒性共線性方差擴大因子(variance inflation factor，VIF)分別為1.2和1.1，說明NK細胞百分數(shù)與殺傷活性兩個自變量之間不存在非完全共線性，可以構(gòu)建線性回歸模型。

圖1 外周血NK細胞百分數(shù)及殺傷活性在孕前及孕期的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of peripheral NK cells perc-entage and cytotoxicity before and during pregnancyNote: A.*.P=0.04,**.P=0.03;B.#.P=0.02,##.P=0.04.

圖2 外周血NK細胞百分數(shù)與殺傷活性間的關(guān)系Fig.2 Correlation between percentage and cytotoxicity of pNK cellsNote: A.Before pregnancy,r=0.3687,95%CI 0.234 0-0.489 6,P=0.000 1;B.At 6 gestational weeks:r=0.232 7,95%CI 0.050 1-0.400 2,P=0.013 1.

表2 pNK 百分數(shù)與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系

Tab.2 Association between pNK percentage and subsequent pregnancy outcomes

VariableNon-adjustedOR 95%CIP valueAdjust Ⅰ1)OR 95%CIP valueAdjustⅡ2)OR 95%CIP valuepNK percentage at baseline<121.01.01.0≥122.98(1.31-6.81)0.009 55.13(1.84-14.30)0.001 84.75(1.57-14.32)0.005 7pNK percentage at 6 gestational weeks<121.01.01.0≥122.52(0.88-7.26)0.085 63.43(1.03-11.46)0.043 36.77(1.06-43.11)0.042 9

Note：1)Adjust Ⅰ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score;2)Adjust Ⅱ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score,pNK cytotoxicity.

表3 pNK殺傷活性與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系

Tab.3 Association between pNK cytotoxicity and subsequent pregnancy outcomes

VariableNon-adjustedOR 95%CIP valueAdjust Ⅰ1)OR 95%CIP valueAdjustⅡ2)OR 95%CIP valuepNK cytotoxicity at baseline<151.01.01.0≥151.57(0.70-3.53)0.274 91.28(0.51-3.21)0.605 50.84(0.30-2.36)0.7443pNK cytotoxicity at 6 gestational weeks<151.01.01.0≥153.23(1.12-9.62)0.029 52.55(0.80-8.10)0.111 51.81(0.54-6.10)0.340 0

Note：1)Adjust Ⅰ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score；2)Adjust Ⅱ model adjust for:Age;BMI;Uterine biophysical score,pNK percentage.

2.4外周血NK細胞百分數(shù)及殺傷活性與再次妊娠結(jié)局 本研究中，將pNK%≥12%定義為陽性，<12%則為陰性。孕前及孕6周pNK%陽性者再次流產(chǎn)率高于陰性者(OR 2.98,95%CI 1.3～6.81,P=0.01;OR 2.52,95%CI 0.88～7.26,P=0.09)。在調(diào)整包括年齡、BMI、子宮生物物理評分在內(nèi)的協(xié)變量后，差異具有統(tǒng)計學意義(OR 5.13,95%CI 1.84～14.3,P=0.01 and OR 3.43,95%CI 1.03～11.46,P=0.04)(表2,調(diào)整Ⅰ)。考慮到pNK%與pNK殺傷活性相關(guān)，我們再次調(diào)整殺傷活性指標(表2，調(diào)整Ⅱ)，最終顯示孕前陽性組流產(chǎn)率為陰性組的4.75倍(OR 4.75,95%CI1.57～14.32,P=0.01)，孕6周時則為6.77倍(OR 6.77,95%CI 1.06～43.11,P=0.04)。

同法分析pNK殺傷活性與后續(xù)妊娠結(jié)局的關(guān)系。將殺傷活性≥15%定義為陽性，孕6周時陽性組較陰性組有更高的流產(chǎn)率(OR 3.23,95%CI 1.12～9.62,P=0.03)(表3)，但在調(diào)整相關(guān)協(xié)變量后，差異不具有統(tǒng)計學差異。

3 討論

免疫因素被認為在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、反復(fù)胚胎移植失敗、不孕等生殖問題中扮演了重要的角色。成功的妊娠需要母體免疫系統(tǒng)對“同種異體移植物”胚胎產(chǎn)生耐受。而NK細胞作為固有免疫系統(tǒng)的一部分，占外周血淋巴細胞的5%～10%，占子宮內(nèi)膜淋巴細胞的70%～90%，在人類的整個妊娠過程中發(fā)揮著重要作用。外周血NK細胞主要為CD56dimCD16+，具有較強的殺傷活性，是抵御病毒入侵和控制腫瘤早期擴散的首要防線，而子宮NK細胞則主要為CD56brightCD16-，分泌大量的細胞因子，如白介素8、干擾素誘導(dǎo)蛋白、金屬蛋白酶及血管生成因子等，促進滋養(yǎng)層細胞侵襲、修復(fù)與重建子宮動脈、改善胚胎血供、維持滋養(yǎng)細胞侵襲和胎盤形成之間的平衡[10]。NK細胞數(shù)量或殺傷活性是否與不良妊娠結(jié)局有關(guān)已成為近年來的研究熱點，而APS作為獲得性易栓癥中最常見的一種，被認為是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要原因，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)RSA合并APS的患者較RSA患者有著更高的NK細胞水平[11]，因此我們猜測易栓因素可能與免疫因素有著潛在關(guān)聯(lián)。盡管遺傳性易栓癥與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系仍存爭議，但不可否認，仍有一些研究發(fā)現(xiàn)遺傳性易栓癥患者有更高的流產(chǎn)發(fā)生率[13-15]。因此本研究選定反復(fù)妊娠失敗合并遺傳性易栓癥患者為研究對象。

相關(guān)研究提示我們異常的NK細胞數(shù)量及殺傷活性或與不良妊娠結(jié)局相關(guān)[16-19]，而升高的pNK細胞水平及殺傷活性可以預(yù)測下次妊娠時正常染色體核型胚胎有較高的發(fā)生流產(chǎn)或生化妊娠的可能[20,21]。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)孕前和孕6周時pNK%為妊娠結(jié)局的獨立危險因素，且和Michou等[22]及Thum等[23]的研究結(jié)果一致，pNK%≥12%可能預(yù)示著更高的再次流產(chǎn)發(fā)生率。但與一些研究結(jié)果不同的是，本研究中增高的pNK細胞殺傷活性并非不良妊娠結(jié)局的獨立危險因素。這可能與研究對象均為有反復(fù)妊娠失敗合并遺傳性易栓癥患者而非正常人群有關(guān)。pNK細胞殺傷活性和數(shù)目的正常范圍至今為止尚無共識，但鑒于越來越多的證據(jù)提示我們NK細胞的調(diào)節(jié)異常及遺傳性易栓癥可能與一些不良妊娠結(jié)局相關(guān)，NK細胞參數(shù)的檢測以及遺傳性易栓癥的篩查被應(yīng)用于臨床，從而出現(xiàn)了使用低分子肝素及阿司匹林改善遺傳性易栓癥妊娠結(jié)局[24,25]，強的松、靜脈滴注免疫球蛋白 (IVIG)及脂肪乳[1,26-28]降低NK細胞水平及殺傷活性，傳統(tǒng)中醫(yī)補腎益氣方誘導(dǎo)pNK細胞向耐受型轉(zhuǎn)變的經(jīng)驗性治療[29]，但對此學術(shù)界是爭議不斷，仍需要進一步大樣本的研究來為臨床治療提供依據(jù)。

綜上，對于反復(fù)妊娠失敗合并遺傳性易栓癥的患者來說，外周血NK細胞百分數(shù)和殺傷活性與更高的再次流產(chǎn)率相關(guān)，但在孕前及孕6周時只有外周血NK細胞百分數(shù)為其獨立危險因素。目前仍需進一步研究來確定pNK細胞百分數(shù)和殺傷活性的正常范圍，幫助選擇可能從治療中受益的患者人群。此外，本研究為回顧性研究，通過調(diào)整協(xié)變量(年齡、BMI、子宮生物物理評分等)來降低偏倚，但本研究結(jié)論尚待大樣本、高質(zhì)量、多中心參與的研究加以驗證。