韋喜生 劉英香 鄭曉君

(中國(guó)人民解放軍第七十四集團(tuán)軍醫(yī)院腫瘤科，廣州 510318)

結(jié)腸癌是我國(guó)的十大惡性腫瘤之一，對(duì)人類健康威脅極大，合理飲食與中藥治療對(duì)其發(fā)生具有一定的預(yù)防作用[1]。目前結(jié)腸癌的主要療法是放療和化療，存在毒副作用較大、易產(chǎn)生耐受性等問(wèn)題[2]。因此，通過(guò)促進(jìn)機(jī)體免疫而對(duì)抗腫瘤發(fā)生的療法越來(lái)越引起臨床醫(yī)生關(guān)注[3,4]。

NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的第一道防線，在抗腫瘤以及抑制自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。NK細(xì)胞通過(guò)直接殺傷作用和釋放TFN-α、IFN-γ等細(xì)胞因子抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。近年來(lái)，中藥多糖和中藥提取物提高NK細(xì)胞殺傷活力來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能抗腫瘤的研究取得一定進(jìn)展[7]。紅花多糖(safflower polysaccharide，SPS)是中藥紅花的有效成分之一[8]。有研究表明，SPS可顯著促進(jìn)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的凋亡，還可促進(jìn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokine activated killer cells，LAK)的殺傷活性，增強(qiáng)免疫功能[9]。本研究在此基礎(chǔ)上研究NK細(xì)胞聯(lián)合SPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的協(xié)同殺傷效應(yīng)，并初步探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞、NK細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)(美國(guó)Gibco)；細(xì)胞板、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(美國(guó)Invitrogen)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)(上海碧云天)；倒置顯微鏡(美國(guó)Olympus)。

1.2方法

1.2.1SPS的制備 參考文獻(xiàn)[10]的方法，紅花1 000 g，充分浸漬，90℃提取4 h，中間不斷攪拌，過(guò)濾，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并兩次提取液濃縮至一定體積，加乙醇終濃度至85%，沉淀物加適量水溶解，置于分液漏斗中，加氯仿充分振蕩，靜置后去除氯仿層，反復(fù)操作6次。水層加95%乙醇沉淀后用無(wú)水乙醇、乙醚洗滌3次，干燥后即得SPS。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，含5 % CO2恒溫箱培養(yǎng),每2～3 d傳代一次。NK細(xì)胞取培養(yǎng)至14 d的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 設(shè)置各濃度實(shí)驗(yàn)組(終濃度分為0、0.315、0.625、1.25、2.5 mg/ml)；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SW480細(xì)胞分別消化接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)，待細(xì)胞貼壁后加入相應(yīng)濃度梯度的SPS，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入20 μl MMT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μl DMSO，振蕩混勻，測(cè)A570 nm，根據(jù)下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=(空白組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/空白對(duì)照組A值×100%。NK細(xì)胞取培養(yǎng)至14 d加入相應(yīng)濃度梯度的SPS，分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h后加入20 μl MMT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入150 μl DMSO，振蕩混勻，測(cè)A570 nm。

1.2.4鈣黃綠素-AM釋放法檢測(cè)殺傷效率 參考文獻(xiàn)[6]的方法，設(shè)置自然釋放組(空白對(duì)照)、最大釋放組(加Triton×100)、SPS組(終濃度0.625 mg/ml)、10∶1 NK組和聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組(10∶1 NK細(xì)胞+SPS)，效靶比為10∶1。SW480細(xì)胞經(jīng)鈣黃綠素-AM染色液染色后，接種于96孔板，據(jù)上述分組加入SPS和NK細(xì)胞，共培養(yǎng)4 h后，取100 μl在酶標(biāo)儀下測(cè)A570 nm 并計(jì)算殺傷效率。計(jì)算公式：細(xì)胞殺傷率=[(實(shí)驗(yàn)組A值-自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-自然釋放組A值)]×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5ELISA法檢測(cè)蛋白表達(dá) 設(shè)置NK細(xì)胞組、NK細(xì)胞+SW480組、NK細(xì)胞+SPS組，NK細(xì)胞+SPS+SW480組，其中效靶比為1∶1，SPS終濃度0.625 mg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SW480細(xì)胞分別消化接種于96孔板，加入相應(yīng)的SPS和NK細(xì)胞，共培養(yǎng) 24 h 后，離心取上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6流式分析法檢測(cè)活化性受體表達(dá)水平和NKG2DLs表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為NK細(xì)胞組、NK細(xì)胞+SW480組、NK細(xì)胞+SPS組，NK細(xì)胞+SPS+SW480組，效靶比為1∶1，SPS終濃度為0.625 mg/ml，將細(xì)胞接種于6孔板，加入相應(yīng)的SPS和NK細(xì)胞，共培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行流式抗體染色。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。結(jié)果用Flowjo 7.6.1軟件處理后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1不同濃度的SPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率 MTT法檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，用不同濃度SPS處理結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后，分別于24 h、48 h、72 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的存活率隨SPS的濃度升高而逐漸顯著下降(P<0.05)。

2.2不同濃度的SPS對(duì)NK細(xì)胞增殖的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，用不同濃度SPS處理NK細(xì)胞后，分別于0 h、24 h、48 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞增殖，在24 h和48 h，相較于0 mg/ml 組，不同濃度SPS組中NK細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但SPS的濃度超過(guò)0.625 mg/ml后增加數(shù)量降低(P<0.05)。

2.3NK細(xì)胞聯(lián)合SPS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷率 實(shí)驗(yàn)選擇終濃度為0.625 mg/ml的SPS。鈣黃綠素-AM釋放法檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，相較于SPS組，10∶1 NK細(xì)胞組對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷率顯著升高，相較于SPS組和10∶1 NK細(xì)胞組，10∶1 NK細(xì)胞+SPS組對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷率也顯著升高(P<0.05)。

Tab.1 Inhibition rate of different concentrations of safflower polysaccharide on colon cancer cells

GroupsInhibition rate(% of 0.000 mg/ml SPS)24 h48 h72 h0 mg/ml SPS0±00±00±00.315 mg/ml SPS6.64±0.371)8.75±1.441)17.64±0.931)0.625 mg/ml SPS12.84±1.291)2)17.53±1.181)2)34.84±1.481)2)1.250 mg/ml SPS20.08±2.111)2)3)28.58±2.071)2)3)47.58±2.791)2)3)2.500 mg/ml SPS34.19±3.521)2)3)4)34.69±2.171)2)3)4)59.69±3.641)2)3)4)F139.453240.845349.911P0.0000.0000.000

Note：1)P<0.05 vs 0 mg/ml SPS;2)P<0.05 vs 0.315 mg/ml SPS;3)P<0.05 vs 0.625 mg/ml SPS;4)P<0.05 vs 1.250 mg/ml SPS.

2.4檢測(cè)各組NK細(xì)胞中TNF-α和IFN-γ的表達(dá) 用ELISA法檢測(cè)各組NK細(xì)胞TNF-α、IFN-γ 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(表4)，相較于NK細(xì)胞組，NK細(xì)胞+SW480組和NK細(xì)胞+SPS組中TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)顯著升高，相較于NK細(xì)胞+SW480組和NK細(xì)胞+SPS組，NK細(xì)胞+SPS+SW480組中TNF-α、IFN-γ 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

GroupsSurvival cell number(×103)0 h24 h48 h0 mg/ml SPS10.05±1.057.11±0.076.25±0.050.315 mg/ml SPS10.18±1.0410.48±1.071)10.98±1.041)0.625 mg/ml SPS10.60±1.1311.60±1.221)12.76±1.281)1.250 mg/ml SPS10.28±1.249.25±0.961)9.58±0.981)2.500 mg/ml SPS10.07±1.119.17±0.891)8.29±0.851)F0.0319.69521.132P0.9980.0020.000

Note：1)P<0.05 vs 0 mg/ml SPS.

GroupsKilling rate(%)SPS10.19±1.2510∶1 NK cell27.58±2.491)10∶1 NK cell+SPS39.37±4.161)2)F77.362P0.000

Note：1)P<0.05 vs SPS group;2)P<0.05 vs 10∶1 NK cell group.

GroupsTNF-αIFN-γNK cell66.18±4.17 48.23±2.49 NK cell+SW48086.33±5.321)59.83±4.951)NK cell+SPS121.60±8.281) 67.46±4.161)NK cell+SPS+SW480183.71±12.671)2)3)107.37±6.311)2)3)F116.00390.100P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NK cell group;2)P<0.05 vs NK cell+SW480 group;3)P<0.05 vs NK cell+SPS group.

2.5檢測(cè)各組NK細(xì)胞中NKG2DLs的表達(dá) 用流式分析法檢測(cè)各組NK細(xì)胞中NKG2DLs的表達(dá)率，結(jié)果顯示(表5)，相較于NK細(xì)胞組，NK細(xì)胞+SW480組和NK細(xì)胞+SPS組中MICA、MICB、ULBP1蛋白表達(dá)顯著升高，相較于NK細(xì)胞+SW480組和NK細(xì)胞+SPS組，NK細(xì)胞+SPS+SW480組中MICA、MICB、ULBP1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。可見(jiàn)，無(wú)論有無(wú)結(jié)腸癌細(xì)胞的存在，NK細(xì)胞中MICA、MICB、ULBP1蛋白的表達(dá)水平均顯著提高，與SPS聯(lián)合后NK細(xì)胞MICA、MICB、ULBP1蛋白的表達(dá)也顯著提高。

2.6檢測(cè)各組NK細(xì)胞中活化性受體表達(dá)水平 流式分析法檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1，表6)，相較于NK細(xì)胞組，NK細(xì)胞+SW480組和NK細(xì)胞+SPS組中NKp46表達(dá)水平顯著升高，相較于NK細(xì)胞組、NK細(xì)胞+SW480組和NK細(xì)胞+SPS組，NK細(xì)胞+SPS+SW480組中NKp46表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

Groups MICA(%)MICB(%)ULBP1(%)NK cell43.41±2.0952.96±2.117.68±0.86NK cell+SW48057.08±3.661)70.59±3.351)12.39±1.371)NK cell+SPS63.22±4.421)78.21±3.841)17.58±1.531)NK cell+SPS+SW48072.51±5.671)2)3)86.30±4.231)2)3)23.26±1.881)2)3)F25.74850.30263.624P0.0000.0000.000

Note：1)P<0.05 vs NK cell group;2)P<0.05 vs NK cell+SW480 group;3)P<0.05 vs NK cell+SPS group.

圖1 各組NK細(xì)胞中活化性受體NKp46表達(dá)流式細(xì)胞圖Fig.1 Flow cytometry of expression of activating receptor NKp46 in NK cells in various groups

GroupsNKp46(%)NK cell55.37±2.61NK cell+SW48067.15±3.541)NK cell+SPS65.45±3.691)NK cell+SPS+SW48075.77±4.071)2)3)F169 66P0.001

Note：1)P<0.05 vs NK cell group;2)P<0.05 vs NK cell+SW480 group;3)P<0.05 vs NK cell+SPS group.

3 討論

結(jié)直腸癌是人類高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，死亡率居惡性腫瘤的第二位[11]?，F(xiàn)有研究證明中藥復(fù)方與化療聯(lián)用或可提高大腸癌的放化療敏感性，減輕不良反應(yīng)并預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)等，對(duì)結(jié)腸癌亦有一定療效[12,13]。

紅花是菊科植物紅花(Carthamustinctorius L.)的干燥花，SPS是紅花的主要有效成分之一，具有抗腫瘤、提高免疫力等作用[14]。SPS可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其抗腫瘤效應(yīng)可能與Bax、Bcl-2、Caspase-3等信號(hào)通路有關(guān)[9]。SPS對(duì)肝癌、宮頸癌的增殖也有一定的抑制作用，并有一定的劑量依賴性[15,16]。SPS可通過(guò)促進(jìn)荷瘤鼠血清IL-12、TNF-α及降低IL-10表達(dá)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抑瘤作用[17]。此外，SPS對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖有抑制作用，相關(guān)機(jī)制可能與提高機(jī)體的自身免疫力有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，SPS可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并有明顯的時(shí)間、濃度依賴性，與前人關(guān)于SPS對(duì)其他腫瘤的作用相符，且本研究中SPS對(duì)NK細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用。

NK細(xì)胞具有分泌細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)、防御感染及溶解破壞腫瘤細(xì)胞等多種重要功能，對(duì)肝癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、腎癌均有顯著殺傷和抑制作用[19-22]。結(jié)直腸癌患者NK細(xì)胞活力顯著降低，治療后NK細(xì)胞活力能迅速激發(fā)的患者預(yù)后較好[23]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NK對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有殺傷作用，與前人結(jié)論相符。激活NK細(xì)胞活性可增強(qiáng)其抗結(jié)直腸癌能力[24]。NK活性主要受其表面的活化性和抑制性受體調(diào)控[25]。上調(diào)NK細(xì)胞活化性受體NKp80，可增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤功能[26]。NKp46是NK細(xì)胞表面活化受體的一種，與配體結(jié)合后可活化NK細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ[27]，本實(shí)驗(yàn)中NKp46與TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平呈正相關(guān)，與該結(jié)論相符，且NK細(xì)胞殺傷力強(qiáng)時(shí)NKp46、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平均顯著升高。NKp46過(guò)表達(dá)增加小鼠中NK細(xì)胞的免疫能力，下調(diào)NKp46促進(jìn)免疫逃逸[28,29]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞與多糖類藥物聯(lián)用具有顯著的抗腫瘤作用。如人參多糖通過(guò)上調(diào)活化受體(NKp30、NKp44、NKp46)的表達(dá)促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的活化，提高其殺傷活性[30]。唐古特白刺果多糖可增加IFN-γ的含量能力和NK細(xì)胞的數(shù)量發(fā)揮抗腫瘤免疫功能[31]。其他某些藥物如舒尼替尼等則可選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)NKG2DLs(MICA、MICB和ULBP2等)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性[32,33]。本研究結(jié)果顯示，SPS可促進(jìn)NK細(xì)胞的TNF-α、IFN-γ分泌及NKp46和NKG2DLs(MICA、MICB、ULBP1)表達(dá)且增強(qiáng)其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷和清除作用。以上研究可說(shuō)明中藥多糖可能增加NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷力。

綜上所述，NK細(xì)胞與SPS聯(lián)合體外殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞具有協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與SPS調(diào)控NK細(xì)胞TNF-α、IFN-γ的分泌及活化性受體和活化性配體表達(dá)水平有關(guān)。我們的研究可為SPS在基于NK細(xì)胞的結(jié)腸癌的臨床免疫治療提供新的思路，對(duì)結(jié)腸癌的免疫治療具有重要意義。