王 道，陳 璇，施曉波，陳建林

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011)

α-L-巖藻糖苷酶1(α-L-fucosidase1, FUCA1)，是細(xì)胞表面上多聚溶酶體酸性水解糖的重要組分，可去除糖蛋白末端L-巖藻糖殘基，而且在酸性pH值下表現(xiàn)出最佳活性。巖藻糖苷酶的缺陷會(huì)引起巖藻糖病，巖藻糖病是一種溶酶體貯積癥，癥狀表現(xiàn)為精神運(yùn)動(dòng)性異常、血管角化瘤和生長(zhǎng)遲緩[1]。到目前為止，學(xué)者們已經(jīng)鑒定出Fuca1基因中29個(gè)不同的突變體存在于染色體1p34上，同時(shí)在機(jī)體內(nèi)免疫、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、精子成熟、配子間相互作用等方面發(fā)揮重要作用[2-4]。近年，研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌[5]和乳腺癌[6]中的α-L-巖藻糖苷酶活性降低，而子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌以及甲狀腺癌[7]和胃癌[8]中活性增加。多項(xiàng)研究[9，10]表明巖藻糖基化與腫瘤發(fā)生之間存在密切聯(lián)系，但對(duì)Fuca1在腫瘤發(fā)生中的功能了解還不夠。王道等[11]研究發(fā)現(xiàn)Fuca1和Fuca2基因在斑馬魚中的各組織廣泛地表達(dá)，而且精巢和卵巢中存在高表達(dá)，提示Fuca1和Fuca2在魚類胚胎發(fā)育和成體的精巢、卵巢與肝臟發(fā)育中可能具有重要的作用。本研究選用小鼠(C57BL/6)，探討Fuca1基因在不同組織器官中的分化表達(dá)情況，為進(jìn)一步了解Fuca1在高等動(dòng)物中性腺發(fā)育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成熟雌雄小鼠(C57BL/6)被人工飼養(yǎng)在湘雅二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，經(jīng)麻醉后迅速分離本研究所需的組織器官(脾臟、心臟、大腦、肌肉、腎臟、睪丸、肝臟和卵巢)，然后用液氮速凍，置于-80 ℃冰箱貯存。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol Reagent購自美國(guó)英偉創(chuàng)津公司；FUCA1特異引物合成購自深圳華大基因公司； PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex TaqTM Mix購自日本Takara公司；鼠抗FUCA1(Ab181357)購自Abcam公司；ABI REAL 96熒光定量PCR儀器購自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 RNA的提取

鑷子夾取小鼠8個(gè)組織樣品置于研缽中，在液氮中充分快速研磨。然后按照Trizol法提取總RNA，并且使用瓊脂糖凝膠(1.3%)電泳跑膠驗(yàn)證RNA完整性。同時(shí)，Beckman分光光度計(jì)驗(yàn)證RNA 濃度和純度：RNA濃度(μg·L-1)=OD260×稀釋倍數(shù)×40，濃度為100～500 μg·L-1；RNA純度=OD260/OD280，比值在1.8～2.0均可。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用qPCR 檢測(cè)Fuca1在小鼠8個(gè)組織(脾臟、心臟、大腦、肌肉、腎臟、睪丸、肝臟和卵巢)中的mRNA表達(dá)水平。qPCR 10 μL反應(yīng)總體系包含：5 μL SYBR Mix，0.3 μL +/-Fuca1特異引物和GAPDH內(nèi)參引物(見表1)，1 μL first cDNA，3.4 μL 無菌H2O，反應(yīng)條件：50 ℃2 min；95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃45 s，45 個(gè)循環(huán)；每個(gè)組織樣本都進(jìn)行3次以上有效重復(fù)。按照8個(gè)組織的樣本擴(kuò)增曲線，確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，并且按照標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物名稱和序列信息

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡雜交

采用Western Blot檢測(cè)小鼠8個(gè)組織(脾臟、心臟、大腦、肌肉、腎臟、睪丸、肝臟和卵巢)中的FUCA1蛋白表達(dá)水平。研缽中研磨剪碎組織至粉末狀并加入液氮，同時(shí)按比例加入蛋白抽提液(含蛋白酶抑制劑)，12 000 r·min-1離心20 min，取上清, 取5 μL 用于測(cè)濃度，其余分裝保存于EP管中。利用Bradford 法測(cè)定總蛋白濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(上樣量100 μg)后，蛋白被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉液室溫封閉1 h。鼠抗FUCA1單克隆抗體(200 g·L-1, 1∶1 000)，鼠抗β-Actin 單克隆抗體(200 g·L-1, 1∶2 000)，在4 ℃冰箱過夜。TBST 洗膜3 次，每次15 min 后，抗鼠IgG-HRP 抗體(1∶2 000)室溫孵育1 h。用TBST 和 TBS分別洗膜2～3次，在暗室進(jìn)行壓片顯影曝光。

1.6 核酸和蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析

從美國(guó)國(guó)立信息庫NCBI獲取10種不同物種的氨基酸序列，用Clustal Omega進(jìn)行多序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR結(jié)果

運(yùn)用qPCR 檢測(cè)Fuca1基因在小鼠8種組織的表達(dá)，ABI系統(tǒng)平臺(tái)說明引物(FUCA1和GAPDH)溶解曲線呈現(xiàn)特異性單峰，最終數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)uca1基因在睪丸表達(dá)量最高，其次是卵巢和腎臟；較低表達(dá)依次出現(xiàn)在大腦、心臟和脾臟，但在肌肉和肝臟表達(dá)量最低(圖1)。

2.2 Western Blot結(jié)果

在小鼠的8種主要組織中， FUCA1蛋白都存在表達(dá)且具有顯著的表達(dá)水平差異性。腎臟中FUCA1蛋白的表達(dá)最高，表達(dá)居中的是卵巢、大腦、心臟、肝臟，肌肉、脾臟和睪丸表達(dá)最低(圖2)。

1. Spleen; 2. Heart; 3. Brain; 4. Muscle; 5. Kidney; 6. Testis; 7. Liver; 8. Ovary圖2 FUCA1在小鼠各組織的蛋白表達(dá)分析Fig. 2 Relative level of FUCA1 protein expression

2.3 氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果

使用Clustal Omega分析軟件對(duì)GenBank中已發(fā)表的10種脊椎動(dòng)物(斑馬魚、雞 、非洲爪蟾、大鼠、小鼠、犬、牛、豬、人、獼猴)的FUCA1氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析(圖3)。結(jié)果顯示，以上物種FUCA1相同的氨基酸有207個(gè)，相似的氨基酸有104個(gè)，同源性僅為43.035%，說明該氨基酸序列保守性不高。

同時(shí)利用Clustal Omega軟件(HH法)對(duì)上述多重比較氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示(圖4)，小鼠和大鼠聚為一支，斑馬魚、雞、非洲爪蟾則聚為另外一支。而且，牛和豬單獨(dú)形成一支，人和獼猴又形成另外一支。與小鼠親緣關(guān)系最近的是大鼠，其次是犬，其它的脊椎動(dòng)物親緣較遠(yuǎn)。

3 討論

FUCA1是一種溶酶體蛋白，在哺乳動(dòng)物中起著重要生理作用[12]，參與了由Fuca1基因突變引起的惡性遺傳疾病。Kielian[13]的研究證實(shí)在大多數(shù)缺陷型小鼠的組織中，很容易檢測(cè)到大量空泡，甚至在腎小球足細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和近端小管觀測(cè)出溶酶體貯藏病理變化。此外，F(xiàn)UCA1還能夠糖基化許多信號(hào)蛋白[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在mRNA水平上，F(xiàn)UCA1在睪丸中表達(dá)最高，在肌肉和肝臟最低；免疫印跡技術(shù)則證實(shí)了FUCA1在小鼠8個(gè)組織都有廣泛的表達(dá)，而且最高表達(dá)出現(xiàn)在腎臟而不是睪丸，脾臟和肌肉中出現(xiàn)最低表達(dá)，有趣的是，與其相應(yīng)的mRNA上表達(dá)比較，可以發(fā)現(xiàn)并非呈線性關(guān)系。根據(jù)以前中心法則，DNA編碼序列被轉(zhuǎn)錄為mRNA，然后被翻譯為蛋白質(zhì)。盡管蛋白質(zhì)的合成及降解的速率均發(fā)生變化，但蛋白質(zhì)的豐度取決于其mRNA的豐度。此過程涉及許多調(diào)控，大量研究報(bào)告認(rèn)為，兩者之間的相關(guān)性通常較低[17-19]。JAX實(shí)驗(yàn)室研究人員測(cè)量來自192個(gè)多樣性近交系小鼠的肝臟中的全基因組轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)表達(dá)，推測(cè)定量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus, QTL)是靶基因附近的遺傳變異，會(huì)影響其表達(dá)，可能QTL會(huì)順式作用并影響轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平，遠(yuǎn)端的QTL對(duì)靶基因在反式中的表達(dá)發(fā)揮作用[20]。人們已經(jīng)在酵母和植物中研究了蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平的一致性，但Anatole等[21]進(jìn)行小鼠比較研究表明，轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的水平僅與約一半的測(cè)試基因顯著相關(guān)，平均相關(guān)系數(shù)為0.27。蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本之間的關(guān)系可能部分能用分子事件來解釋，如翻譯效率、選擇性剪接、折疊、組裝成復(fù)合物；轉(zhuǎn)運(yùn)和定位、共價(jià)修飾、分泌和降解等都會(huì)影響蛋白質(zhì)水平，而且與轉(zhuǎn)錄本無關(guān)。本文結(jié)果中睪丸組織的轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平表達(dá)不一致，筆者推測(cè)是該基因翻譯過程中可能接受一系列的化學(xué)修飾信號(hào)，如miRNA，使其蛋白水平下調(diào)，翻譯表達(dá)后被部分降解[22,23]，還可能是在翻譯后受到磷酸化、硫酸化、泛素化等。

“*”代表保守的氨基酸殘基;“:”代表保守替換的氨基酸殘基;“.”代表相似性氨基酸。圖3 不同脊椎動(dòng)物FUCA1氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 3 Amino acid sequence analysis of FUCA1 from different species

圖4 不同物種FUCA1系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of FUCA1 in different species

關(guān)于Fuca1在生殖領(lǐng)域的作用研究越來越多，特別是在大鼠、果蠅及海鞘等動(dòng)物中，F(xiàn)uca1與性腺發(fā)育及精卵識(shí)別融合有關(guān)[24,25]。Maria等[26]發(fā)現(xiàn)果蠅不同組織Fuca1mRNA表達(dá)存在差異性，且精巢中表達(dá)最高，王道等[11]也發(fā)現(xiàn)在斑馬魚精巢和卵巢中FUCA1的表達(dá)量較高，黃鱔中的FUCA1在雌性性腺中的表達(dá)量明顯高于雄性性腺[27]。以往文獻(xiàn)[28，29]報(bào)道加入FUCA1抗體能使小鼠受精率下降,添加外源性FUCA1能促進(jìn)精子獲能，因此筆者推測(cè)Fuca1可能在小鼠性腺發(fā)育及精子成熟過程中起重要作用，這有待我們深入研究來提供更多證據(jù)。