郭海婷，譚 潔，夏春波，榮翠平，鄒珍友，李中原,2

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種重要的機(jī)會致病性原蟲，專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生，能夠感染包括人類在內(nèi)的所有恒溫動物，對人體健康、公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)均危害嚴(yán)重[1-2]。值得注意的是，弓形蟲分布極其廣泛，擁有速殖子、緩殖子和卵囊等多種感染形態(tài)，能夠突破血-腦和血-胎屏障造成人和動物感染，但作用機(jī)制至今尚不清楚，是深入研究病原微生物觸發(fā)生命體行為異常和解析先天性感染幸存胎兒智力發(fā)育不全作用機(jī)理的重要模式生物[3-5]。作為毒株傳代、制備突變株、開展預(yù)實驗和驗證實驗結(jié)果的中心環(huán)節(jié)，體外培養(yǎng)對探明弓形蟲速殖子毒力基因功能及其致病機(jī)制都至關(guān)重要[6]。據(jù)報道，以24孔細(xì)胞板對弓形蟲RH株速殖子進(jìn)行體外培養(yǎng)時，蟲體感染量與宿主細(xì)胞起初鋪入數(shù)間緊密相關(guān)[7]，至于弓形蟲其他毒株或培養(yǎng)類型，目前尚無報道。因此，本文以非洲綠猴腎細(xì)胞(即Vero細(xì)胞)為研究對象，運(yùn)用96孔、24孔、12孔、6孔細(xì)胞板和25T培養(yǎng)瓶對弓形蟲VEG株速殖子進(jìn)行體外培養(yǎng)，經(jīng)Real-time PCR定量和曲線擬合分析，旨在探討不同感染梯度的弓形蟲速殖子對宿主細(xì)胞侵蝕能力強(qiáng)弱的影響及二者間存在的接種比例關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1弓形蟲毒株與細(xì)胞系 弓形蟲VEG蟲株(Genotype III)受中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室朱興全研究員惠贈，宿主Vero細(xì)胞系由廣西腦與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點實驗室傳代保存。

1.1.2主要儀器、耗材和試劑 MX3005P型Real-time PCR熒光定量基因擴(kuò)增儀購自德國Agilent公司；96孔、24孔、12孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(平底)和25T細(xì)胞培養(yǎng)瓶(斜頸，矩形)為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；TIANamp Genomic DNA Kit購自天根生化科技(北京)有限公司；Real-time PCR EasyTM SYBR Green I為福際生物技術(shù)(成都)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 待傳代的宿主Vero細(xì)胞系經(jīng)0.25%胰酶消化和血細(xì)胞計數(shù)板精確計數(shù)后，用10% FBS/DMEM培養(yǎng)液稀釋至1.0×105個/mL，按照每孔0.1 mL、0.5 mL、1.2 mL和2.5 mL的上液量分別鋪入96孔、24孔、12孔和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板；將所得細(xì)胞稀釋至1.74×105個/mL，移取4.5 mL鋪入25T培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h，備用。

常規(guī)培養(yǎng)并收集弓形蟲VEG株速殖子，經(jīng)破碎、純化和計數(shù)后用10% FBS/DMEM培養(yǎng)基稀釋至1.0×105個/mL并倍比稀釋出7個濃度梯度，依次加入上述96孔(0.1 mL/孔)和24孔(0.5 mL/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板中；將所得速殖子分別稀釋至1.5×105個/mL、5.0×105個/mL和1.56×106個/mL，并作同上倍比稀釋，按0.8 mL/孔、0.5 mL/孔或0.5 mL/瓶的感染劑量依次加入上述12孔、6孔細(xì)胞板或25T培養(yǎng)瓶中，以使首孔/首瓶內(nèi)宿主細(xì)胞鋪入數(shù)與弓形蟲感染數(shù)相同；于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)4 d，實驗重復(fù)3次。

1.2.2樣品收集與DNA提取 待培養(yǎng)結(jié)束，運(yùn)用移液器槍頭或細(xì)胞刮刮凈并全量收集96孔、24孔細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)物，其他細(xì)胞板和培養(yǎng)瓶內(nèi)所得物經(jīng)充分吹打混勻和測定總體積后各取0.5 mL，分別用于基因組提取，具體操作方法依照天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Genomic DNA Kit使用說明進(jìn)行(洗脫體積均為50 μL)。

1.2.3Real-time PCR定量檢測 精確計數(shù)弓形蟲VEG株速殖子8.3×106個，同上提取基因組并10倍稀釋出6個濃度梯度，用來繪制所需的標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)文獻(xiàn)[8]，合成一對用來定量分析待檢樣品中弓形蟲VEG株速殖子數(shù)目的特異性引物(即上游：5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′；下游：5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)，經(jīng)Real-time PCR定量擴(kuò)增，分別計算出感染4 d時各細(xì)胞板和培養(yǎng)瓶內(nèi)的蟲體數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1弓形蟲VEG株速殖子數(shù) 參照文獻(xiàn)[8]，合成一對特異性引物(預(yù)期擴(kuò)增片段大小為121 bp)，經(jīng)Real-time PCR定量檢測來系統(tǒng)評價不同感染梯度的弓形蟲VEG株速殖子作用4 d時對侵蝕宿主Vero細(xì)胞能力的影響，所得結(jié)果如表1所示。不難發(fā)現(xiàn)，弓形蟲速殖子對宿主細(xì)胞侵蝕能力的強(qiáng)弱程度與其感染量和所用耗材規(guī)格間關(guān)系密切，即速殖子感染量及所用耗材對弓形蟲侵蝕宿主細(xì)胞的能力均影響明顯。

表1 弓形蟲VEG株接入宿主細(xì)胞4 d時各培養(yǎng)孔/瓶內(nèi)的速殖子數(shù)目Tab.1 Number of parasites in the well or bottle at 4 d post-infection with T. gondii VEG strain

2.2曲線擬合與回歸趨勢分析 假設(shè)自變量x[即LOG(VEG速殖子感染數(shù)/宿主細(xì)胞數(shù)，2)]與因變量y[即培養(yǎng)4 d時各細(xì)胞板和培養(yǎng)瓶內(nèi)VEG速殖子數(shù)]之間有回歸關(guān)系，本文依照最小二乘法基本原理[9-10]，運(yùn)用多項式函數(shù)(二次、三次和四次)、線性函數(shù)、指數(shù)函數(shù)以及生長曲線(Pearl model和Gompertz model)等7種常見曲線回歸模型對弓形蟲VEG株速殖子感染宿主Vero細(xì)胞4 d時的蟲體平均數(shù)進(jìn)行擬合分析，并分別求解殘差平方和Q值、決定系數(shù)R2和F值。結(jié)果顯示，擬合四次多項式時所得Q值最小，且決定系數(shù)R2、F值最大(圖1)，表明四次多項式為弓形蟲速殖子感染宿主細(xì)胞4 d時的最佳擬合曲線方程，其回歸趨勢如圖2所示。

Note: * indicates that the regression trend for the fitting curve is inconsistent with the expected results.圖1 7種常見回歸曲線的擬合度分析Fig.1 Fitting degree analyses for the seven common models of regression curves

A: Quantitative analysis curve for the Real-time PCR; B-F: The numbers of VEG parasites at 4 d post-infection and their regression curves for 96-, 24-, 12-, 6-well plates and 25 T bottles, respectively (n=3).圖2 Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線與最佳擬合函數(shù)方程的回歸趨勢分析Fig.2 Standard curves for Real-time PCR and the regression trend analyses for the best model

2.3參數(shù)統(tǒng)計與建議接種比 運(yùn)用Excel工具和SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件，分別對感染4 d時96孔、24孔、12孔、6孔細(xì)胞板和25T培養(yǎng)瓶中VEG速殖子所得最佳回歸函數(shù)方程的擬合系數(shù)進(jìn)行求解，結(jié)果如表2所示。

通過對所有四次多項式函數(shù)求二階導(dǎo)數(shù)和令其為0，分別解得：96孔板，x1=-7.90，x2=-2.85；24孔板，x1=-6.34，x2=-2.41；12孔板，x1=-5.99，x2=-2.18；6孔板，x1=-5.93，x2=-2.01；25T培養(yǎng)瓶，x1=-5.43，x2=11.48，故96孔、24孔、12孔、6孔細(xì)胞板和25T培養(yǎng)瓶作用4 d時VEG速殖子感染數(shù)與宿主細(xì)胞數(shù)間建議接種比依次為2-7.90(舍棄)或2-2.85，2-6.34(舍棄)或2-2.41，2-5.99(舍棄)或2-2.18，2-5.93(舍棄)或2-2.01，2-5.43或211.48(舍棄)，即1/7.20，1/5.32，1/4.53，1/4.03和1/43.02(表2)。

3 討 論

作為一種重要的人獸共患性原蟲，剛地弓形蟲已經(jīng)成為探討病原微生物導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病如人和動物行為異常、幸存胎兒智力發(fā)育不全及其作用機(jī)制的主要模式生物[5,11]。加之，體外培養(yǎng)弓形蟲是獲取速殖子、產(chǎn)生目的基因缺失株及其補(bǔ)充株、進(jìn)行預(yù)實驗和所得結(jié)論驗證的重要途徑，對闡明弓形蟲引起機(jī)體發(fā)病及其分子機(jī)制的作用不容忽視[12-13]。因此，研究弓形蟲速殖子感染量與宿主細(xì)胞起初鋪入數(shù)間的接種比例具有實用價值。前期研究結(jié)果顯示，采用24孔細(xì)胞板對弓形蟲RH株速殖子進(jìn)行體外培養(yǎng)時，后者感染量與宿主Vero細(xì)胞鋪入數(shù)之間存在接種比例關(guān)系[7]，對于其他蟲株或培養(yǎng)類型，至今沒有報道。因此，本研究繼續(xù)以Vero細(xì)胞為實驗對象，分別用96孔、24孔、12孔、6孔細(xì)胞板和25T培養(yǎng)瓶對VEG株速殖子進(jìn)行體外培養(yǎng)，保證宿主細(xì)胞鋪入密度及首個速殖子感染濃度與細(xì)胞起初鋪入數(shù)相同的情況下作用4 d，經(jīng)Real-time PCR定量，以7種常見曲線回歸模型對所得速殖子數(shù)目的平均值進(jìn)行擬合分析，明確所用耗材規(guī)格與弓形蟲速殖子起初感染量對侵蝕宿主細(xì)胞能力影響的同時，探討存在二者之間的接種比例關(guān)系。

表2 細(xì)胞培養(yǎng)板/瓶內(nèi)速殖子最佳回歸曲線的參數(shù)統(tǒng)計與建議接種比Tab.2 Parameters of the best regression curves and the inoculation ratios for T. gondii in plate or bottle

Real-time PCR定量檢測結(jié)果顯示，弓形蟲VEG株速殖子起初感染量與所用耗材規(guī)格均對弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的能力影響明顯，提示同種耗材培養(yǎng)條件下，蟲體感染量與宿主細(xì)胞鋪入數(shù)間關(guān)系緊密。經(jīng)曲線擬合進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，四次多項式是弓形蟲感染宿主細(xì)胞4 d時的最適回歸曲線方程，且所得速殖子無法擬合冪和對數(shù)兩種函數(shù)類型，與我們前期研究結(jié)果相一致[7]。通過對所得四次多項式求導(dǎo)和求極值認(rèn)為，運(yùn)用同種耗材對弓形蟲速殖子及其宿主細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)時，二者之間存在最優(yōu)接種比例關(guān)系，即96孔、24孔、12孔、6孔細(xì)胞板和25T培養(yǎng)瓶依次為1/7.20、1/5.32、1/4.53、1/4.03和1/43.02。綜上所述，所用耗材的培養(yǎng)規(guī)格是造成各組間最優(yōu)接種比差異明顯的關(guān)鍵因素，所得結(jié)果可為日后深入研究弓形蟲速殖子與宿主細(xì)胞間及二者與所用耗材規(guī)格間互相作用關(guān)系提供重要實驗室參考依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：郭海婷，譚潔，夏春波，等.剛地弓形蟲VEG株速殖子感染宿主細(xì)胞最優(yōu)接種比的曲線擬合分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2020，36(2)：105-109. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2020.00.020