許建本 蘇秀芳 黃妹膠

(1. 廣西民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣西 崇左 532200；2. 廣西高校桂西南特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西 崇左 532200)

黃花草是山柑科藥用植物，主要分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)云南、廣西和福建等地都有種植[1]，其種子可入藥、榨油，鮮葉可用于治療眼病[2]。目前有關(guān)黃花草的研究主要集中于藥用價(jià)值及重金屬脅迫下種子萌發(fā)等方面，如Parimaladevi等[3]研究了黃花草提取物對(duì)老鼠的止痛作用機(jī)制，周鑫磊[4]研究了Mn2+對(duì)黃花草種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)等的影響及脅迫生理生化特征的變化，而關(guān)于黃花草有效成分及抗氧化方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。黃酮類成分是普遍存在于植物體中的一種天然抗氧化劑，具有抗氧化[5]、抑菌[6]和抗病毒[7]等藥理作用。目前提取植物體中總黃酮的常見(jiàn)方法有溶劑浸提法、酶輔助提取法和超聲輔助提取法等，其中超聲輔助提取法因具有簡(jiǎn)單、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[8]。

試驗(yàn)擬以黃花草為原料，采用超聲輔助法提取黃花草中的總黃酮，優(yōu)化其提取工藝條件，并研究黃花草總黃酮對(duì)·OH、DPPH·和亞硝酸鹽的清除能力，以期為黃花草的研究及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃花草：摘自廣西崇左市江州區(qū)市政府公園，經(jīng)廣西民族師范學(xué)院黃秋蟬教授鑒定為山柑科植物黃花草(CleomeviscosaL.)；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：生化試劑，上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?/p>

無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

鹽酸萘乙二胺：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：≥97.0%，阿拉丁公司；

氫氧化鈉：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

95%乙醇、30%過(guò)氧化氫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、水楊酸、七水合硫酸亞鐵等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：JA1003N，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：7200型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

超聲波清洗器：SG2200HPT型，上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃花草的預(yù)處理工藝流程

黃花草洗凈→電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干(60 ℃)→粉碎→過(guò)篩(60目)→脫脂脫色(石油醚中浸泡、攪拌)→抽濾→烘箱干燥(50 ℃)→避光保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 黃花草總黃酮的提取 取1.000 0 g黃花草粉末，加入一定量乙醇溶液，充分混勻，設(shè)定提取功率，在一定溫度下超聲提取至指定時(shí)間，過(guò)濾，將濾液定容至50 mL容量瓶中，搖勻備用。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)文獻(xiàn)[9]，修改如下：先用70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇溶液配制0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，再準(zhǔn)確吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mL 0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于比色管中，用70%乙醇溶液定容，搖勻備用。吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的比色管中，加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min；隨后加入0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；再加入4.0 mL 4% 氫氧化鈉溶液，然后用70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后放置反應(yīng)15 min，以70%乙醇溶液作為空白，于510 nm處測(cè)定溶液吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=10.882x-0.000 2，R2=0.999 7，說(shuō)明在此濃度范圍內(nèi)，吸光度與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度具有較好線性關(guān)系。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 乙醇濃度：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶20 (g/mL)分別與30%，40%，50%，60%，70%的乙醇混合，提取功率30 W，在60 ℃下超聲提取20 min，分析乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響。

(2) 料液比：取1.000 0 g黃花草粉末，分別按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率30 W，在60 ℃下超聲提取20 min，分析料液比對(duì)總黃酮得率的影響。

(3) 提取功率：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率分別為30，40，50，60，70 W，在60 ℃下超聲提取20 min，分析提取功率對(duì)總黃酮得率的影響。

(4) 提取溫度：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率分別為40 W，分別在30，40，50，60，70 ℃下超聲提取20 min，分析提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響。

(5) 超聲時(shí)間：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率分別為40 W，在50 ℃下分別超聲提取20，30，40，50，60 min，分析超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以對(duì)總黃酮得率影響較大的4個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(3)4正交試驗(yàn)，以黃花草總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化黃花草總黃酮提取工藝。

1.2.6 黃花草總黃酮得率的測(cè)定 吸取1.0 mL樣品液于10 mL比色管中，按“1.2.3”方法測(cè)定吸光度，再根據(jù)式(1)計(jì)算總黃酮得率。

(1)

式中：

C——總黃酮得率，%；

m——黃花草提取液的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

M——黃花草干粉質(zhì)量，mg。

1.2.7 黃花草總黃酮抗氧化活性測(cè)定

(1) 對(duì)羥基自由基(·OH)清除能力的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[10]，修改如下：分別在10 mL比色管中加入1 mL不同濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的黃花草總黃酮提取液，再加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，搖勻，然后加入2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液，充分搖勻，最后加入2 mL 8.8 mmol/ L H2O2，搖勻。靜置30 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)照組以蒸餾水代替H2O2?？瞻捉M以蒸餾水代替黃花草總黃酮提取液。按式(2)計(jì)算·OH清除率。

(2)

式中：

K1——·OH清除率，%；

A1——樣品組吸光度；

A2——對(duì)照組吸光度；

A3——空白組吸光度。

(2) 對(duì)DPPH自由基(DPPH·)清除能力的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[11]。

(3) 對(duì)亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定：根據(jù)文獻(xiàn)[12]，修改如下：分別在10 mL比色管中加入2 mL不同濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的黃花草總黃酮提取液，再加入5 mL pH 3.0的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液，1 mL 100 μg/mL 亞硝酸鈉溶液，將混合物置于37 ℃的恒溫水浴鍋中1 h，取出，立即加入2 mL 4 mg/mL對(duì)氨基苯磺酸，搖勻，靜置5 min，再加入1 mL 2 mg/mL鹽酸萘乙二胺，用蒸餾水定容，搖勻，靜置15 min后，在540 nm 處測(cè)定吸光度，VC作為陽(yáng)性對(duì)照?？瞻捉M以蒸餾水代替黃花草總黃酮提取液。按式(3)計(jì)算亞硝酸鹽清除率。

(3)

式中：

K2——亞硝酸鹽清除率，%；

A——樣品組吸光度；

A0——空白組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excle (Office 2010)、Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黃花草總黃酮得率的影響 從圖1可以看出，適當(dāng)提高乙醇濃度，總黃酮得率增大。這是因?yàn)殡S著乙醇濃度增大，溶劑與黃酮類成分的極性越來(lái)越接近，黃花草細(xì)胞發(fā)生溶脹現(xiàn)象，有利于總黃酮溶出。當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，黃花草總黃酮得率達(dá)到最大。繼續(xù)增加乙醇濃度，溶劑與黃酮類成分的極性差異增大，影響了黃酮類成分的溶解性[13]，而且黃花草中醇溶性雜質(zhì)大量溶出，這些雜質(zhì)與黃酮類成分競(jìng)爭(zhēng)溶劑，導(dǎo)致總黃酮得率減小。因此，選擇最佳乙醇濃度為50%。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃花草總黃酮得率的影響

Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.2 料液比對(duì)黃花草總黃酮得率的影響 從圖2可以看出，隨著料液比增大，黃花草總黃酮得率先增大后減小。這是因?yàn)樵谝粋€(gè)合適的料液比范圍內(nèi)，增加溶劑，黃花草細(xì)胞內(nèi)總黃酮和溶劑的濃度差增大，加大了傳質(zhì)效率，有利于總黃酮溶出[14]，因此，總黃酮得率增大。當(dāng)料液比為1∶15 (g/mL)時(shí)，總黃酮得率最大。繼續(xù)增加料液比，溶劑量過(guò)大，超聲輔助效果減小，還會(huì)加大非黃酮類成分的溶出，導(dǎo)致總黃酮得率減小[15]。因此，選擇最佳料液比為1∶15 (g/mL)。

圖2 料液比對(duì)黃花草總黃酮得率的影響

Figure 2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.3 提取功率對(duì)黃花草總黃酮得率的影響 從圖3可以看出，提取功率在30～40 W范圍時(shí)，黃花草總黃酮得率隨著功率增大而增大。這是因?yàn)槌暡ň哂袡C(jī)械波動(dòng)作用和空化效應(yīng)[16]，適當(dāng)增加超聲波功率，可以提高對(duì)黃花草細(xì)胞壁的破壞效果，有利于總黃酮溶出。當(dāng)超聲波功率為40 W時(shí)，總黃酮得率最大。繼續(xù)增加功率，黃酮類成分結(jié)構(gòu)被過(guò)強(qiáng)的超聲波破壞，總黃酮得率下降。因此，選擇最佳提取功率為40 W。

2.1.4 提取溫度對(duì)黃花草總黃酮得率的影響 從圖4可以看出，黃花草總黃酮得率隨著溫度升高呈先增大后減小的趨勢(shì)，50 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大。這是因?yàn)檫m當(dāng)升高溫度可以增加分子動(dòng)能，加快分子運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)總黃酮的滲透擴(kuò)散能力，使得總黃酮得率增大。當(dāng)提取溫度高于50 ℃ 時(shí)，部分不穩(wěn)定黃酮類成分的結(jié)構(gòu)被破壞，且在高溫下乙醇易揮發(fā)，導(dǎo)致溶劑濃度降低，不利于總黃酮溶出[17]，使得總黃酮得率下降。綜合考慮，選擇最佳提取溫度為50 ℃。

圖3 提取功率對(duì)黃花草總黃酮得率的影響

Figure 3 Effect of extraction power on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

圖4 提取溫度對(duì)黃花草總黃酮得率的影響

Figure 4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)黃花草總黃酮得率的影響 從圖5可以看出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃花草總黃酮得率先增大后減小。這是因?yàn)樵?0～50 min內(nèi)，黃花草細(xì)胞壁逐漸被破壞，總黃酮從開(kāi)始溶出至全部溶出，所以總黃酮得率逐漸增大。再繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間地加熱和超聲會(huì)使溶出的總黃酮被氧化或分解，導(dǎo)致總黃酮得率下降。因此，選擇最佳提取時(shí)間為50 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)黃花草總黃酮得率的影響

Figure 5 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、乙醇濃度、提取功率和超聲時(shí)間4個(gè)條件為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。提取溫度取50 ℃，試驗(yàn)因素水平取值見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，各因素對(duì)黃花草總黃酮得率的影響順序?yàn)镈>B>C>A，即：超聲時(shí)間>乙醇濃度>提取功率>料液比。最佳提取工藝組合為A2B2C2D2，即料液比為1∶15 (g/mL)，乙醇濃度為50%，提取功率為40 W，超聲時(shí)間為50 min。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到黃花草總黃酮得率為(2.711±0.002)%，說(shuō)明通過(guò)正交試驗(yàn)得到的最佳工藝條件穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好。

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取1.0 mL最佳提取條件下得到的黃花草提取液3份，分別加入到3個(gè)10 mL比色管中，再在各比色管中分別加入1.0 mL 0.200 0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，靜置15 min后按“1.2.3”方法測(cè)定吸光度，得到回收率的均值為99.58%，RSD=0.78%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于黃花草總黃酮得率的測(cè)定。

2.4 黃花草總黃酮的抗氧化性

2.4.1 黃花草總黃酮對(duì)·OH的清除能力 由圖6可知，隨著濃度增加，黃花草總黃酮和VC對(duì)·OH的清除率均增大。當(dāng)黃花草總黃酮的濃度為0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH 的清除率達(dá)到(52.48±0.88)%，說(shuō)明黃花草總黃酮對(duì)·OH具有一定清除能力，但作用效果弱于VC。

圖6 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)·OH的清除效果

2.4.2 黃花草總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力 從圖7可以看出，在濃度為0.05～0.25 mg/mL時(shí)，黃花草總黃酮和VC對(duì)DPPH·均具有較強(qiáng)的清除能力。當(dāng)濃度為0.05 mg/mL 時(shí)，VC對(duì)DPPH·的清除率為(95.25±0.43)%，繼續(xù)增加濃度，清除率無(wú)明顯變化。黃花草總黃酮對(duì)DPPH·的清除率隨著濃度的增大而增大，當(dāng)其濃度為0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到(95.58±0.28)%，清除能力接近VC，說(shuō)明黃花草總黃酮對(duì)DPPH·具有很好的清除效果。

圖7 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)DPPH·的清除效果

2.4.3 黃花草總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除能力 從圖8可以看出，當(dāng)濃度為0.05，0.10 mg/mL時(shí)，黃花草總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除能力強(qiáng)于VC，繼續(xù)增大濃度，黃花草總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除能力弱于VC。當(dāng)濃度為0.25 mg/mL 時(shí)，黃花草總黃酮和VC對(duì)亞硝酸鹽的清除率分別為(57.27±0.15)%，(85.59±0.21)%，說(shuō)明黃花草總黃酮對(duì)亞硝酸鹽具有一定的清除能力，但弱于VC。

圖8 不同質(zhì)量濃度樣品對(duì)亞硝酸鹽的清除效果

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，黃花草總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶15 (g/mL)，乙醇濃度50%，提取功率40 W，超聲時(shí)間50 min，提取溫度50 ℃，此條件下得到黃花草總黃酮得率為(2.711±0.002)%。在考察的濃度范圍內(nèi)，黃花草的抗氧化能力隨總黃酮濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)總黃酮濃度為0.25 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH、DPPH·和亞硝酸鹽的清除率分別為(52.48±0.88)%，(95.58±0.28)%，(57.27±0.15)%。黃花草中的總黃酮是一種活性較好的抗氧化劑。試驗(yàn)僅研究了黃花草總黃酮的超聲輔助提取工藝及抗氧化活性，采用其他提取技術(shù)總黃酮得率如何，黃花草中總黃酮的開(kāi)發(fā)利用還有待進(jìn)一步研究。