余騰飛 唐年初 劉誠毅

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 海南博禾農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，海南 海口 570100)

憂遁草學(xué)名鱷嘴花(Clinacanthusnutans)，又被稱為沙巴蛇草、青箭等，爵床科鱷嘴花屬，廣泛分布于華南熱帶至馬來西亞、爪哇、加里曼丹，在中國海南、廣東、廣西和云南等地的低海拔疏林或灌叢內(nèi)均有分布。研究表明，憂遁草具有抗高血脂活性[1]、免疫活性[2-3]、抗氧化性[4-5]、抗癌特性[6-7]和抗菌特性[8]等生物活性。憂遁草含有較豐富的多糖，而關(guān)于憂遁草多糖的相關(guān)研究報(bào)道較少，僅Huang等[9]從憂遁草中分離出了一種多糖—肽復(fù)合物，并表明該復(fù)合物具有免疫調(diào)節(jié)作用。

目前，多糖的提取方法有熱水浸提法、酶輔助提取法[10]、超聲提取法[11]、微波輔助提取法[12]、超臨界流體萃取法[13]、超聲微波協(xié)同提取法[14]和超高壓提取法[15]等。相比之下，熱水浸提法成本低且安全，在實(shí)際的多糖提取中應(yīng)用最為廣泛。試驗(yàn)擬采用熱水浸提法提取憂遁草多糖，并對多糖的抗氧化性進(jìn)行評價(jià)，為憂遁草多糖的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

憂遁草：海南博禾農(nóng)業(yè)有限公司；

粉末活性炭：阿拉丁試劑有限公司；

ABTS、DPPH：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易公司；

無水乙醇、硫酸、苯酚、過硫酸鉀、抗壞血酸、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水:分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE5203型，上海亞榮儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-18型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；

電熱恒溫震蕩水槽：DKZ型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

分光光度計(jì)：UVmini-1240型，日本島津公司；

高速多功能粉碎機(jī)：HC-350Y型，永康市天祺盛世工貿(mào)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 憂遁草多糖提取工藝路線

鮮葉采摘→曬干→粉碎機(jī)粉碎過40目篩→按一定比例加入去離子水提取→趁熱過濾得上清液→60 ℃減壓濃縮→加入4倍體積無水乙醇醇沉過夜→將沉淀物經(jīng)丙酮、無水乙醇各洗兩次→凍干得粗多糖

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 根據(jù)SN/T 4260—2015的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，得回歸方程y=64.361x+0.001，R2=0.999 4。

1.3.3 多糖提取率計(jì)算 按式(1)計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——多糖提取率，%；

C——稀釋后的多糖濃度，mg/mL；

V——復(fù)溶多糖溶液的體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

m——憂遁草粉末質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

(1) 提取時(shí)間：稱取憂遁草粉末5.000 g，固定料液比1∶25 (g/mL)，提取溫度80 ℃，考察提取時(shí)間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)對憂遁草多糖提取率的影響，3次平行。

(2) 料液比：稱取憂遁草粉末5.000 g，固定提取時(shí)間1.5 h，提取溫度80 ℃，考察料液比[1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]對憂遁草多糖提取率的影響，3次平行。

(3) 提取溫度：稱取憂遁草粉末5.000 g，固定料液比1∶30 (g/mL)，提取時(shí)間1.5 h，考察提取溫度(60，70，80，90，100 ℃)對憂遁草多糖提取率的影響，3次平行。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比、提取溫度和提取時(shí)間為因素，多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化憂遁草多糖提取工藝。

1.3.6 憂遁草多糖抗氧化性研究

(1) 對ABTS自由基的清除能力：參考Xu等[16]的方法并略作修改。將15 mL ABTS溶液(7 mmol/L)與15 mL 過硫酸鉀溶液(5 mmol/L)混合，暗處靜置12 h，用去離子水稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02。將0.5 mL 粗多糖溶液分別稀釋成0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL，與制備的ABTS溶液(3 mL)混合，室溫下震蕩10 min，測定734 nm處吸光度值。以去離子水代替多糖溶液作為空白對照，以去離子水代替ABTS溶液作為樣品對照，以抗壞血酸(VC)為陽性對照，按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率。

(2)

式中：

Y——自由基清除率，%；

A0——空白對照組吸光度值；

A1——樣品試驗(yàn)組吸光度值；

A2——樣品對照組吸光度值。

(2) 對DPPH自由基的清除能力：參考Xu等[16]的方法并略作修改。分別取2.0 mL濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的粗多糖溶液，與3 mL新制備的0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合并反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光度值。以乙醇溶液代替多糖溶液作為空白對照，以去離子水代替DPPH溶液作為樣品對照，以抗壞血酸(VC)為陽性對照，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(3) 對羥基自由基的清除能力：參考王麗霞等[17]的方法并略作修改。分別取2.0 mL濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL多糖溶液，與2.0 mL硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)、水楊酸—乙醇溶液(6 mmol/L)、雙氧水(6 mmol/L)混勻，靜置20 min，測定510 nm處吸光度值。以去離子水代替雙氧水作為空白對照，以去離子水代替多糖溶液作為樣品對照，以抗壞血酸(VC)為陽性對照，按式(2)計(jì)算羥基自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6、OriginPro 8.5和Excel 2016等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的增加，多糖提取率先上升后趨于穩(wěn)定，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)達(dá)到峰值，可能是0.5～1.5 h多糖溶解不充分，而溶解完全后，提取時(shí)間對憂遁草多糖提取率的影響變?nèi)酰瑥亩苟嗵翘崛÷授呌诜€(wěn)定[18]。隨著液料比的增加，多糖提取率先迅速增長后趨于平穩(wěn)，料液比為1∶30 (g/mL)時(shí)達(dá)到峰值，可能是傳質(zhì)阻力隨著液料比的增加而不斷減小，多糖擴(kuò)散速率加?。欢诹弦罕冗_(dá)到1∶30 (g/mL)后，多糖溶液已趨于飽和，溶劑作用不再顯著，因此多糖提取率趨于穩(wěn)定[19]。隨著提取溫度的升高，多糖提取率先迅速增長后緩慢下降，可能是60～90 ℃的升溫過程破壞了憂遁草的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，加快了多糖從細(xì)胞中釋放；當(dāng)溫度超過90 ℃時(shí)，多糖被氧化，分子結(jié)構(gòu)受到破壞的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，引起多糖提取率下降[20]。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝

2.2.1 回歸模型的建立與方差分析 以憂遁草多糖提取率為響應(yīng)值，以料液比、提取溫度和提取時(shí)間為變量，設(shè)計(jì)三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖1 各因素對憂遁草多糖提取率的影響

表1 試驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由軟件分析可得二次回歸方程：

Y=-41.875+0.958 5A+0.632 62B+1.932 5C-0.001 75AB+0.041AC-0.002 0BC-0.014 1A2-0.003 15B2-0.92C2。

(3)

由表3可知，模型P<0.000 1，表明此模型具有顯著性；失擬項(xiàng)P為0.162 6，即失擬項(xiàng)不顯著；擬合度為0.990 9，說明該模型與實(shí)際情況擬合較好；校正擬合系數(shù)為0.979 2，表明該回歸方程能真實(shí)反映3個(gè)因素與多糖提取率間的關(guān)系；A、B、C、AB、AC、A2、B2和C2對提取率的影響極顯著；各因素對多糖提取率的影響依次為提取時(shí)間>提取溫度>料液比。

表3 方差分析表?

2.2.2 各因素間的交互作用 由圖2可知，料液比和提取溫度、料液比和提取時(shí)間的曲面坡度較陡，且各自的等高線呈橢圓形，表明AB、AC的交互作用對多糖提取率影響顯著；提取溫度和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面坡度較小，且等高線呈圓形，表明BC間的交互作用對多糖提取率影響不顯著；交互作用分析結(jié)果與方差分析結(jié)果吻合。

2.2.3 最佳工藝驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析可知，憂遁草多糖的最佳提取工藝為料液比1∶30.79 (g/mL)，提取溫度91.58 ℃，提取時(shí)間1.644 h，該條件下預(yù)測的多糖提取率為3.48%。根據(jù)實(shí)際操作的可行性，選擇料液比1∶31 (g/mL)，提取溫度92 ℃，提取時(shí)間1.6 h為最終的工藝條件，此時(shí)實(shí)測多糖提取率為3.40%(n=3)，與預(yù)測值較接近。

圖2 兩因素的交互作用對多糖提取率的影響

2.3 多糖的抗氧化活性

2.3.1 對ABTS自由基的清除效果 由圖3可知，ABTS自由基清除率隨憂遁草多糖濃度的增大先迅速增大后趨于平緩。當(dāng)憂遁草多糖濃度為3 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除率為94.93%，IC50為0.981 mg/mL。多糖對ABTS自由基的清除效果與VC相當(dāng)，說明憂遁草多糖對ABTS自由基具有良好的清除效果。

圖3 憂遁草多糖對ABTS自由基的清除曲線

Figure 3 Scavenging ability of crude polysaccharide ofClinacanthusnutanson ABTS free radical

2.3.2 對DPPH自由基的清除效果 由圖4可知，DPPH自由基清除率隨憂遁草多糖濃度的增大先迅速增大后趨于穩(wěn)定，當(dāng)憂遁草多糖濃度為3 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)83.49%，IC50為2.449 mg/mL。結(jié)合對照組VC的清除效果可知，憂遁草多糖具有良好的DPPH自由基清除效果。

圖4 憂遁草多糖對DPPH自由基的清除曲線

Figure 4 Clearance curve of polysaccharide ofClinacanthusnutanson DPPH free radical

2.3.3 對羥基自由基的清除效果 由圖5可知，羥基自由基清除率與憂遁草多糖濃度呈正相關(guān)，當(dāng)憂遁草濃度為3 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)67.20%，IC50為1.461 mg/mL。結(jié)合對照組VC的清除效果可知，憂遁草多糖具有一定的羥基自由基清除能力。

圖5 憂遁草多糖對羥基自由基的清除曲線

Figure 5 Clearance curve of polysaccharide ofClinacanthusnutanson OH free radical

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用熱水浸提法提取憂遁草多糖，并優(yōu)化了憂遁草多糖的提取工藝。結(jié)果表明，憂遁草多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶31 (g/mL)，提取溫度92 ℃，提取時(shí)間1.6 h，此條件下多糖提取率為3.40%?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，憂遁草多糖具有良好的ABTS自由基和DPPH自由基清除效果，并具有一定的羥基自由基清除能力，說明憂遁草多糖可作為一種具有開發(fā)潛力的天然抗氧化劑新資源。后續(xù)可深入研究憂遁草多糖的結(jié)構(gòu)及功效。