馬文錦 李梅林 王 博 周彥兵 彭 濤 張永顯 于長青 班省華

(甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730000)

膠紅酵母是一種抗逆性較強(qiáng)的腐生酵母，含有包括7種人體必需氨基酸在內(nèi)的16種常見的氨基酸，6種脂肪酸，以及豐富的類胡蘿卜素、VE、核苷酸和蝦青素等微量元素[1]。胞外多糖(exo-polysaccharide，EPS)是由微生物包括細(xì)菌、真菌、藻類釋放到周圍環(huán)境中促進(jìn)細(xì)胞生長，抑制溶菌酶，儲(chǔ)存營養(yǎng)和加強(qiáng)耐有毒重金屬的一類多糖[2]。近年來，膠紅酵母的研究主要集中在其類胡蘿卜素[3-4]的富集培養(yǎng)條件和優(yōu)良菌株的篩選[5-6]等方面。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，酵母菌胞外多糖(YEPS)具有潛在的抗氧化、抗凝血、抗血栓和抗病毒活性，可用于生產(chǎn)有機(jī)體免疫調(diào)節(jié)劑。目前，國內(nèi)外對細(xì)菌胞外多糖和一些大型真菌胞外多糖的研究較多[9]，而對酵母菌胞外多糖的菌株篩選、結(jié)構(gòu)解析和功能活性研究較少[10]，尤其膠紅酵母胞外多糖的結(jié)構(gòu)解析和功能活性尚未見報(bào)道。

課題組[11]前期通過醇沉，脫蛋白，透析等方法得到膠紅酵母CICC 33013菌株代謝的胞外多糖(REPS)，復(fù)溶后經(jīng)DEAE-52纖維素層析和Sephadex G-100凝膠柱層析分離純化，高效凝膠滲透色譜法色譜圖顯示胞外多糖組分REPS2-A是單一、對稱峰，表明得到的膠紅酵母胞外多糖組分REPS2-A是均相樣品，根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)，胞外多糖組分REPS2-A的平均分子量為7.125×106Da。并基于紅外光譜、核磁共振和甲基化分析，確定了膠紅酵母胞外多糖組分REPS2-A是高度分支的多糖，由(1→3)-連接的Gal為骨架組成，分支是由(1→2)-連接的Glc、(1→4)-連接的Man、(1→3)-連接的Glc、(1→4,6)-連接的Man和(1→2,3,4)-連接的Ara組成。有研究[12-13]表明，具有抗腫瘤活性的甘露聚糖多為(1→6)鍵型，活性半乳糖則以(1→3)糖苷鍵連接。試驗(yàn)擬從增殖、凋亡與周期等方面分析評價(jià)胞外多糖組分REPS2-A對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用，為膠紅酵母胞外多糖在食品與藥品中的應(yīng)用提供理論支持和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠紅酵母菌株(RhodotorulamucilaginosaCICC 33013)：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；

血癌細(xì)胞K562、胃癌細(xì)胞BGC823、SGC7901、MKN28、肝癌細(xì)胞HepG2、BEL7402、Hep3B、胰腺癌細(xì)胞HS66T、乳腺癌細(xì)胞SKBR3、宮頸癌細(xì)胞HeLa：蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；

RPMI 1640培養(yǎng)液：武漢凌飛科技有限公司；

胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；

磷酸鹽緩沖溶液、胰酶：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

青霉素—鏈霉素溶液：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：廣州威佳科技有限公司；

其他試劑：均為分析純；

流式細(xì)胞儀：LDZX-30KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

倒置顯微鏡：HH-4型，金壇市宏華儀器廠；

酶聯(lián)免疫檢測儀：DG5033A型，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；

離心機(jī)：CT15RT型，上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；

搖床振蕩器：ZD-9550型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：UV-1100型，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 癌細(xì)胞篩選 在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組癌細(xì)胞，選取生長良好的各癌細(xì)胞[14]。選出的細(xì)胞進(jìn)行分類處理：① 懸浮類細(xì)胞直接移入無菌的離心管進(jìn)行離心；② 貼壁類細(xì)胞移除原有的培養(yǎng)基，用PBS清洗2～3次，加入1～2 mL胰酶靜止3～5 min，加入完全培養(yǎng)液終止消化，移入無菌的離心管，離心條件為1 000 r/min、5 min，移除上清液。

將對數(shù)生長期的血癌細(xì)胞K562、胃癌細(xì)胞BGC823、胃癌細(xì)胞SGC7901、胃癌細(xì)胞MKN28、肝癌細(xì)胞HepG2、BEL7402、Hep3B、胰腺癌細(xì)胞HS66T、乳腺癌細(xì)胞SKBR3、宮頸癌細(xì)胞HeLa接種在無菌的96孔板，接種濃度約為104個(gè)/mL，重復(fù)7次，并設(shè)置空白對照組，加入多糖(濃度為1.0 mg/mL)，混合均勻放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去上清液，加入RPMI 1640培養(yǎng)液和MTT溶液，于37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，分別加入DMSO，置于搖床上低速振蕩10～15 min，使結(jié)晶物溶解完全。在波長為490 nm條件下對各孔的吸光值進(jìn)行測定[15-16]。細(xì)胞增殖抑制率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——細(xì)胞增殖抑制率，%；

Ap——試驗(yàn)組吸光值；

AC——空白組吸光值。

1.2.2 多糖藥物對HepG2細(xì)胞作用濃度及時(shí)效性測定 經(jīng)過篩選肝癌細(xì)胞HepG2為后續(xù)主要的研究對象。在96孔板內(nèi)接種對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，使每孔細(xì)胞數(shù)約為1.0×104個(gè)。多糖濃度分別為0.0，0.5，1.0，10.0 mg/mL，做6個(gè)重復(fù)并設(shè)置空白對照，并以人正常細(xì)胞株(L02)和Oxaliplatin處理HePG2分別為陰性和陽性對照組。加樣完成后振蕩均勻，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24，48，72 h進(jìn)行測定[17]。

1.2.3 HepG2細(xì)胞凋亡檢測 多糖作用于HepG2細(xì)胞的濃度為1.0 mg/L，未添加多糖的細(xì)胞做為空白對照。放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72 h形成3個(gè)試驗(yàn)組，每組各做3個(gè)平行。培養(yǎng)結(jié)束后移除培養(yǎng)液，加入PBS，細(xì)胞刮分散細(xì)胞，移入離心管離心(1 000 r/min，4 ℃，5 min)，移除上清，收集細(xì)胞。吸取10 μL細(xì)胞沉淀懸于190 μL結(jié)合緩沖液，加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素細(xì)胞凋亡顯像劑，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入295 μL 結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測，上機(jī)前5 min加入5 μL PI(碘化丙啶)[18-19]。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約106個(gè)/mL，同時(shí)設(shè)不加HepG2細(xì)胞對照組和濃度為1.0 g/L的多糖作用24，48，72 h的試驗(yàn)組，培養(yǎng)結(jié)束后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 細(xì)胞周期測定 將培養(yǎng)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約106個(gè)/mL，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照組和濃度為1.0 g/L的多糖作用24，48，72 h的試驗(yàn)組。用PBS清洗2次，勻漿細(xì)胞，用預(yù)冷的75%酒精(1～3 mL)固定，加入PI，置4 ℃避光染色30 min，400目尼龍網(wǎng)過濾后，將樣品加入流式細(xì)胞儀，氬離子激發(fā)PI熒光，波長488 nm處測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Sigmaplot 12.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果用(x±s)表示，3個(gè)平行試驗(yàn)，采用ANOVA進(jìn)行Duncana多重比較分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖組分REPS2-A對不同癌細(xì)胞的作用

采用MTT法研究多糖組分REPS2-A對10種常見癌細(xì)胞的抑制作用，效果如圖1所示。結(jié)果表明，多糖組分REPS2-A對選取的10種癌細(xì)胞都有一定的抑制作用，癌細(xì)胞的種類不同，抑制效果亦不相同。其中血癌細(xì)胞K562、胃癌細(xì)胞BGC823、胃癌細(xì)胞SGC7901、胃癌細(xì)胞MKN28、肝癌細(xì)胞BEL-7402、肝癌細(xì)胞Hep3B、胰腺癌細(xì)胞HS66T、乳腺癌細(xì)胞SKBR3、宮頸癌細(xì)胞HeLa 9種癌細(xì)胞的抑制率均低于50%，說明多糖組分REPS2-A對這些細(xì)胞沒有明顯的抑制效果，可能是自發(fā)凋亡引發(fā)的結(jié)果。對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率明顯的高于其他9種癌細(xì)胞，其抑制率為62%，高于50%，說明多糖組分REPS2-A對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制具有特異性。因此后續(xù)試驗(yàn)選取肝癌細(xì)胞HepG2作為研究對象。

圖1 多糖REPS2-A對不同癌細(xì)胞的抑制結(jié)果

2.2 多糖組分REPS2-A溶液的濃度及時(shí)效性分析

如圖2所示，隨著多糖組分REPS2-A溶液濃度的增加，其對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率逐漸升高，而隨著作用時(shí)間的延長，多糖REPS2-A溶液對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率變化范圍較小，說明在一定的時(shí)間(72 h)內(nèi)，時(shí)間的變化對多糖REPS2-A溶液的作用效果影響不大。當(dāng)濃度低于1.0 mg/mL時(shí)，多糖REPS2-A溶液對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率均低于50%，說明多糖組分REPS2-A溶液濃度低于1.0 mg/mL時(shí)的研究意義不大。濃度為1.0 mg/mL時(shí)，多糖組分REPS2-A溶液對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率均高于50%，對正常肝細(xì)胞L02的抑制率為31%，說明在該濃度下肝癌細(xì)胞HepG2得到了較好的抑制效果。當(dāng)濃度為10.0 mg/mL時(shí)，抑制率接近100%，此時(shí)的多糖組分REPS2-A溶液的濃度太高影響了細(xì)胞的生長，因此，無實(shí)際研究意義。

以經(jīng)典抗癌藥物奧沙利鉑作為陽性對照，給予鉑類藥物后，肝癌細(xì)胞HepG2的生長均受到明顯抑制，細(xì)胞生長密度明顯降低，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少。隨著給藥濃度增強(qiáng)和給藥時(shí)間延長，鉑類藥物對肝癌細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，以24～48 h的抑制作用最為明顯。以藥物作用48 h肝癌細(xì)胞株的IC50值顯示：HepG2細(xì)胞株對鉑類藥物敏感。相比多糖作為抑制劑，10 mg/L多糖對肝癌細(xì)胞的抑制率與0.1 mg/L奧沙利鉑藥物的相當(dāng)。

2.3 多糖組分REPS2-A對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

由圖3、4可知，未經(jīng)多糖組分REPS2-A處理的HepG2細(xì)胞的自發(fā)凋亡率是0.40%；當(dāng)多糖組分REPS2-A濃度為1 mg/mL作用24，48，72 h時(shí)，其細(xì)胞早期凋亡率分別為73.74%，36.00%，27.88%，凋亡率分別為77.70%，88.18%，97.08%。與對照組相比，多糖組分REPS2-A能促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡。

圖2 REPS2-A溶液對肝癌細(xì)胞(HepG2)作用的濃度與時(shí)效性

圖3 REPS2-A濃度為1 mg/mL時(shí)不同時(shí)間HepG2細(xì)胞凋亡分析

圖4 REPS2-A濃度為1 mg/mL時(shí)不同時(shí)間(24，

Figure 4 The apoptosis rate of HepG2 cells at different time (24, 48 and 72 h) when the concentration of reps2-a was 1 mg/mL

2.4 多糖組分REPS2-A對HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

由圖5可以看出，HepG2細(xì)胞在REPS2-A作用下生長、繁殖受到明顯的抑制，并且隨著濃度的增加抑制效果有明顯的增加。

2.5 多糖組分REPS2-A對HepG2細(xì)胞周期的影響

用流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞在多糖組分REPS2-A濃度為0.0，0.1，0.5，1.0 mg/mL，作用24 h各試驗(yàn)組細(xì)胞周期的變化，結(jié)果如圖6和表1所示。隨著濃度的增加，G0～G1期細(xì)胞所占百分比升高，表明G1/S期發(fā)生阻滯。

圖5 不同多糖REPS2-A濃度處理時(shí)HepG2

Figure 5 Morphological characteristics of HepG2 cells treated with different concentrations of polysaccharide REPS2-A

周期分析結(jié)果與細(xì)胞生長形態(tài)影響結(jié)果相一致，當(dāng)REPS2-A濃度為0.0，0.1，0.5，1.0 mg/mL作用24 h后。多糖組分REPS2-A對HepG2細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以膠紅酵母CICC 33013代謝的胞外多糖組分REPS2-A為研究對象，揭示膠紅酵母胞外多糖在肝腫瘤細(xì)胞活性中的抑制作用，結(jié)果顯示：當(dāng)多糖組分REPS2-A濃度為1 mg/mL，作用時(shí)間分別為24，48，72 h時(shí)，肝癌細(xì)胞HepG2凋亡率分別為77.70%，88.18%，97.08%。采用流式細(xì)胞儀測定多糖對HepG2細(xì)胞作用周期，結(jié)果顯示：多糖組分REPS2-A溶液使HepG2細(xì)胞在G1/S期發(fā)生阻滯。試驗(yàn)證實(shí)膠紅酵母胞外多糖能有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，其機(jī)制之一是REPS2-A使HepG2細(xì)胞阻滯發(fā)生在G1/S期，并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

]Debris：細(xì)胞碎片，Aggregates：聚集體，Dip G1：G1期DNA的相對含量，Dip G2：G2期DNA的相對含量，Dip S：S期DNA的相對含量

圖6 不同濃度的REPS2-A處理24 h的HepG2細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析圖

Figure 6 Flow cytometry analysis of HepG2 cells treated with REPS2-A of various concentrations:0.0 (control), 0.1, 0.5, 1.0 mg/mL for 24 h

表1多糖REPS2-A不同濃度處理的HepG2細(xì)胞的周期分析表

Table1ThecellcyclesofHepG2treatedwithvariousconcentrationofREPS2-A

濃度/(mg·mL-1)細(xì)胞所占百分比/%G0～G1期S期G2～M期0.061.00 24.4614.540.168.9627.943.110.571.5628.090.351.075.0923.990.92

膠紅酵母胞外多糖有可能成為治療肝癌的天然產(chǎn)品或作為抗腫瘤藥的輔助藥物，但膠紅酵母胞外多糖對于癌癥的抑制通路機(jī)制、膠紅酵母胞外多糖的毒性以及產(chǎn)糖相關(guān)的優(yōu)異基因仍不清楚，需進(jìn)一步深入研究。