周霞，張文倩，劉炬，李麗，劉付紅，劉炳男

研究表明，神經(jīng)保護劑在臨床上未達到理想的治療效果［1］，但其促使神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）成為缺血性損傷新的治療方向并受到臨床廣泛關(guān)注［2］。NVU 由LO 等于2002 年提出，指由神經(jīng)元、微血管、星形膠質(zhì)細胞及其軸突和其他支持細胞共同組成的復合體，是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位［3］。神經(jīng)元的修復必須依賴能量，而微血管網(wǎng)絡(luò)是能量輸送的基礎(chǔ)，這可能是單純應用神經(jīng)保護劑未達到理想治療效果的癥結(jié)所在。基于此，臨床上提出了通過促進缺血后病灶區(qū)血管新生及微循環(huán)網(wǎng)絡(luò)重建而保護NVU 的構(gòu)想。血管內(nèi)皮細胞既是微血管的基本結(jié)構(gòu)，又具有復雜的代謝及內(nèi)分泌功能。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生長因子，可誘導血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及局部毛細血管新生等；此外，其還是一個多效性神經(jīng)保護因子，具有促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）分泌［4］、抗凋亡［5］及促進軸突生長、神經(jīng)再生、遷移等作用［6］。因此，通過調(diào)控VEGF、促進微血管新生可保護NVU的主要成分［7］。

地黃是治療中風經(jīng)典方劑中的常用藥，如地黃飲子（宋·《圣濟總錄》）、大秦艽湯（金·劉完素《素問病機氣宜保命集》）等。梓醇是地黃的主要有效成分，以生地黃含量最高。既往采用地黃梓醇干預局灶性腦缺血大鼠模型的實驗發(fā)現(xiàn)，干預后大鼠腦缺血周圍區(qū)皮質(zhì)微血管數(shù)量明顯增加，提示地黃梓醇具有促血管新生作用［8-9］，但其具體機制尚未明確。筆者所在課題組前期研究結(jié)果顯示，腦出血急性期采用生地注射液治療有助于神經(jīng)功能恢復，尤其對陰虛風動型腦出血效果更明顯［10］。本研究旨在從VEGF 及其受體調(diào)控角度探討地黃梓醇促血管新生作用及分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 實驗時間為2019 年4—8 月，人臍靜脈 內(nèi) 皮 細 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自中科院上海細胞庫。在含有1%雙抗、10% DMEM 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVECs，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37 ℃恒溫，二氧化碳（CO2）含量為5%。

1.2 主要試劑與儀器 梓醇購自上海源葉科技有限公司（純度≥98%，分子量為362.33），以終濃度為1 mg/ml的梓醇溶液作為神經(jīng)保護最佳濃度［11］；VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR-1）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）引物購自鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司，兔抗VEGF（AF5131）、兔抗VEGFR-1（H00002321）、兔抗VEGFR-2（92006）及兔抗GAPDH（14C10）購自Affinity biologicals 公 司，VEGFR-1、VEGFR-2 抗 體 購自Abcam 公司，MTT 試劑盒購自索萊寶公司，RNA 提取試劑盒（Qiagen）購自天根生化科技（北京）有限公司，RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（Applied Biosystems）及ViiA ? 7 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT 法 采用MTT 法檢測細胞增殖能力，具體如下：將對數(shù)期HUVECs 以1×105ml 的密度接種于96 孔板中，細胞長至60%～70%后更換不含血清的培養(yǎng)基并分別加入0.9%氯化鈉溶液（對照組）、梓醇溶液1 mg/ml（實驗組）繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后向待測孔中加入MTT 溶液5 mg/ml，4 h 后向每孔加入二甲基亞砜（DMSO），搖床振蕩10 min 后在490 nm 波長下測量每孔吸光度值（OD 值），并計算細胞相對增殖率。

1.3.2 細胞遷移實驗 采用細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力，具體如下：將HUVECs 均勻接種于6 孔板中，鋪板前在板的背面用記號筆劃5～6 道平行的橫線，細胞長至80%～90%后采用無菌200 μl 槍頭管尖（約0.7 mm）在各培養(yǎng)板相同位置劃垂直或平行直線，與以上橫線垂直，造成幾條“傷口”。之后采用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，去除被槍頭管尖破壞而脫落的細胞并拍照，然后更換不含血清的培養(yǎng)基并分別加入0.9%氯化鈉溶液（對照組）、梓醇溶液1 mg/ml（實驗組）進行處理，培養(yǎng)0、12、24 h 后觀察細胞遷移情況，并計算100 倍顯微鏡下4 個獨立視野中超過劃線的細胞數(shù)，實驗重復3 次并取平均值。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR） 分別采用0.9%氯化鈉溶液（對照組）、梓醇溶液1 mg/ml（實驗組）干預HUVECs 36 h，之后采用qRT-PCR 檢測VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達情況，具體如下：分別采用RNA 提取試劑盒和RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑提取RNA 及合成cDNA，采用ViiA ? 7 Real-Time PCR System 進行qRT-PCR 分析。95 ℃ 30 s，95℃ 10 s、60 ℃ 32 s 重復40 個循環(huán)，將GAPDH 作為內(nèi)參計算目的基因相對表達量，qRT-PCR 重復3 次并取平均值。VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 及GAPDH 引物序列見表1。

表1 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 及GAPDH 引物序列Table 1 Primer sequences of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2 and GAPDH

1.3.4 免疫印跡法 qRT-PCR 后采用免疫印跡法檢測VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 蛋白表達情況，具體如下：（1）提取蛋白：采用4 ℃預冷的PBS 沖洗細胞2 次，根據(jù)培養(yǎng)面積不同加入一定體積的0.1% SDSRIPA 裂解液及100 μM PMSF，其中RIPA:PMSF 比例為100:1，將其靜置于冰上15 min，然后將細胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中反復吹打。4 ℃環(huán)境下13.8×g 離心15 min，收取上清液并提取細胞總蛋白質(zhì)。（2）采用BCA 法檢測蛋白濃度。（3）蛋白變性：向蛋白質(zhì)樣品中加入一定體積的上樣緩沖液，95 ℃環(huán)境下加熱5 min使蛋白變性。（4）電泳：將蛋白質(zhì)加入聚丙烯酰胺凝膠點樣孔，并于80 V 恒壓下電泳約30 min，然后在120 V恒壓下電泳約60 min，當有色染料移至聚丙烯酰胺凝膠末端時停止電泳。（5）轉(zhuǎn)膜：配制1×轉(zhuǎn)膜液，制作轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)，280 mA 恒流轉(zhuǎn)膜合適時間。（6）封閉：采用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，封閉完成后采用TBS-T 緩沖液洗滌15 min，共洗滌3 次。（7）抗體孵育：采用抗體稀釋液按比例配制一抗工作液，4 ℃孵育過夜，第2 天孵育二抗。（8）顯影：將PVDF 膜浸入ECL 發(fā)光液中進行顯影和分析，采用Image J 軟件定量分析蛋白，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗，兩組間比較采用成組t 檢驗，組內(nèi)比較采用配對t 檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 地黃梓醇對HUVECs 增殖能力的影響 對照組HUVECs 的OD 值 為（0.366±0.103），低 于 實 驗 組的（0.674±0.135），差異有統(tǒng)計學意義（t=7.12，P=0.04）；與對照組相比，實驗組HUVECs 相對增殖率為（1.871±0.152）%。

2.2 地黃梓醇對HUVECs 遷移能力的影響 以培養(yǎng)0 h為對照，實驗組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細胞數(shù)量多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組HUVECs 培養(yǎng)24 h 遷移細胞數(shù)量均多于培養(yǎng)12 h，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 兩組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細胞數(shù)量比較（±s）Table 2 Comparison of number of migrating cells between the two groups 12，24 hours after culture

表2 兩組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細胞數(shù)量比較（±s）Table 2 Comparison of number of migrating cells between the two groups 12，24 hours after culture

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2.3 地黃梓醇對HUVECs VEGF 及其受體表達的影響 兩組HUVECs VEGFR-1 的mRNA 及蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗組HUVECs VEGF、VEGFR-2 的mRNA 及蛋白相對表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖1～2）。

3 討論

圖1 兩組HUVECs VEGF 及其受體mRNA 相對表達量比較Figure 1 Comparison of relative mRNA expression quantity of VEGF and its receptors between two groups

圖2 兩組HUVECs VEGF 及其受體蛋白相對表達量比較Figure 2 Comparison of relative protein expression quantity of VEGF and its receptors between the two groups

美國神經(jīng)疾病和腦卒中研究院曾指出，在細胞、分子、基因?qū)用嫜芯磕X卒中后NVU 的變化及其機制將為缺血后腦保護研究提供新的方向，但NVU 作為一個功能單位，因細胞間存在大量信號傳導及對話而使研究者較難找準研究的切入點。筆者所在課題組認為腦缺血后微血管網(wǎng)絡(luò)重建與神經(jīng)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)，其中血管新生是微循環(huán)重建的主要途徑。

血管新生包括內(nèi)皮細胞激活、增殖及遷移等一系列過程，其中內(nèi)皮細胞遷移是血管新生的必要環(huán)節(jié)。VEGF 可作用于血管內(nèi)皮細胞表面相應受體并激活相關(guān)轉(zhuǎn)導通路，進而促進血管新生，但其配體及受體類型較多，既往研究表明，血管生產(chǎn)效應主要與兩個酪氨酸激酶結(jié)合有關(guān)，即VEGFR-1 和VEGFR-2［6］。盡管與VEGFR-1 相比，VEGFR-2 與VEGF 結(jié)合能力較弱，但VEGF/VEGFR-2 激活的細胞信號級聯(lián)反應仍是VEGF信號通路的主要生物學效應［8］，因此VEGFR-1 常被認為是假受體［12］。

生地黃是祖國醫(yī)學中治療中風的主要藥物之一，現(xiàn)代研究表明其主要有效成分梓醇具有一定神經(jīng)保護作用［11，13］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》明確記載，“生地味甘寒，主折跌絕筋、傷中、逐血痹?！陨哂攘肌！钡笫啦怀Ｓ闷洹盎钛?、逐血痹”之功效。正如近代醫(yī)家張山雷在《本草正義》中記載：“惟唐宋以降，破血逐瘀諸方，已無復采用及此者”，張山雷認為：“地黃……，惟破血一層，似乎寒涼粘滯性質(zhì)必無破瘀導滯之功，誤認為其膩滯物質(zhì)而遂疑古人之言”［14］。藥理學研究表明，生地黃炮制成熟地黃的過程主要為梓醇逐減及糖類遞增，且梓醇隨著炮制、加熱程度加深而逐漸分解或丟失［15-16］。因此，筆者認為生地黃具有活血生新功效，其中梓醇是體現(xiàn)其“活血生新”功效的有效成分［17］。

現(xiàn)代醫(yī)家認為，“生新”包括“生新血”和“生新脈”兩方面，其中“生新脈”具有促血管新生、微循環(huán)重建等內(nèi)涵。本研究結(jié)果顯示，對照組HUVECs 的OD值低于實驗組，且與對照組相比，實驗組HUVECs 相對增殖率為（1.871±0.152）%，提示地黃梓醇能有效提高HUVECs 增殖能力；以培養(yǎng)0 h 為對照，實驗組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細胞數(shù)量多于對照組，提示地黃梓醇能有效提高HUVECs 遷移能力，進而促進血管新生。本研究結(jié)果還顯示，兩組HUVECs VEGFR-1 的mRNA 及蛋白相對表達量間無統(tǒng)計學差異，但實驗組HUVECs VEGF、VEGFR-2 的mRNA 及蛋白相對表達量均高于對照組，提示地黃梓醇通過特異性上調(diào)VEGF 及VEGFR-2 表達而發(fā)揮促血管新生作用，這也從分子生物學層面闡示了地黃“活血生新”功效的內(nèi)涵：地黃梓醇通過調(diào)控VEGF 和VEGFR-2 靶向性結(jié)合而促進血管新生。

綜上所述，地黃梓醇通過上調(diào)VEGF、VEGFR-2表達而促進HUVECs 增殖、遷移，進而發(fā)揮促血管新生作用，但VEGF 與VEGFR-2 結(jié)合后如何激活下游因子及受哪種上游因子調(diào)控尚未明確，仍有待課題組進一步探究。

作者貢獻：周霞、張文倩進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負責文章的質(zhì)量控制及審校；張文倩、劉炬、李麗進行研究的實施與可行性分析；張文倩、劉炳男進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；周霞、張文倩、劉付紅負責撰寫論文；周霞對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。