[摘要] 目的 探討胰島素樣生長因子-1（IGF-1）與瘦素、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、免疫球蛋白-E（IgE）的相關(guān)性及其對肥胖型哮喘的作用。方法 C57BL/6J小鼠40只，隨機分為對照組、肥胖組、哮喘組、肥胖型哮喘組，卵蛋白（OVA）腹腔注射構(gòu)建哮喘模型，高脂飲食誘導(dǎo)肥胖。檢測各組肺泡灌洗液（BALF）白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)，應(yīng)用ELISA方法檢測BALF和血清IGF-1、瘦素、IL-6、IgE水平，RT-PCR方法檢測肺組織黏蛋白5AC（MUC5AC）mRNA表達(dá)。結(jié)果 肥胖型哮喘組、哮喘組和肥胖組的白細(xì)胞總數(shù)和各分類細(xì)胞數(shù)、MUC5AC mRNA表達(dá)水平、IGF-1、瘦素、IL-6、IgE均高于對照組，且肥胖型哮喘組以上各指標(biāo)均高于哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=119.3～3 447.3，Plt;0.05）。血清IGF-1水平與瘦素水平呈正相關(guān)（r=0.889，Plt;0.05），BALF中IGF-1與IL-6、IgE均呈正相關(guān)（r=0.940、0.905，Plt;0.05）。結(jié)論 IGF-1與IgE、瘦素、IL6存在正向調(diào)節(jié)關(guān)系，加重和促進(jìn)肥胖型哮喘小鼠肺部炎癥和氣道黏液高分泌。

[關(guān)鍵詞] 哮喘;小鼠，肥胖;胰島素樣生長因子Ⅰ;瘦素

[中圖分類號] R562.25 "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A "[文章編號] 2096-5532（2020）05-0597-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.109 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[ABSTRACT] Objective To investigate correlation of insulin-like growth factor-1 （IGF-1） with leptin， interleukin-6 （IL-6）， and immunoglobulin E （IgE） and its effect on obese asthma. "Methods A total of 40 C57BL/6J mice were randomly divided into control group， obesity group， asthma group， and obese asthma group. Intraperitoneal injection of ovalbumin was performed to establish a model of asthma， and high-fat diet was given to induce obesity. Total leukocyte count and differential leukocyte counts in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were measured; ELISA was used to measure the levels of IGF-1， leptin， IL-6， and IgE in serum and BALF， and RT-PCR was used to measure the mRNA expression of mucoprotein 5AC （MUC5AC） in lung tissue. "Results Compared with the control group， the obese asthma group， the asthma group， and the obesity group had significantly hi-gher total leukocyte count and differential leukocyte counts， mRNA expression of MUC5AC， and levels of IGF-1， leptin， IL-6， and IgE， and the above indices were significantly higher in the obese asthma group than in the asthma group （F=119.3-3 447.3，Plt;0.05）. The serum level of IGF-1 was positively correlated with leptin （r=0.889，Plt;0.05）， and in BALF， IGF-1 was positively correlated with IL-6， and IgE （r=0.940，0.905;Plt;0.05）. "Conclusion IGF-1 has positive correlation with IgE， leptin， and IL-6 and thus exacerbates and promotes lung inflammation and airway mucus hypersecretion in mice with obese asthma.

[KEY WORDS] asthma; mice， obese; insulin-like growth factor Ⅰ; leptin

目前，哮喘和肥胖是世界面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一[1]。肥胖可誘發(fā)哮喘發(fā)作、加重哮喘癥狀，導(dǎo)致哮喘控制和住院治療的效果較差[2]。肥胖型哮喘是一種復(fù)雜的綜合征，其發(fā)生機制尚不清楚[3]。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）在哮喘和肥胖的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用[4]。本文通過研究IGF-1與瘦素、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、免疫球蛋白-E（IgE）的相關(guān)性，為有效控制肥胖型哮喘提供新的思路及理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 取3周齡C57BL/6J健康小鼠40只，體質(zhì)量10～12 g（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），國際飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)、清潔環(huán)境飼養(yǎng)，普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。室溫保持在25～27 ℃，相對濕度50%～70%。

1.1.2 實驗儀器與試劑 HD 001高脂飼料（北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司）;卵蛋白（OVA，美國Sigma公司）;氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司）;多功能誘咳引喘儀（YLS-8A，北京金洋萬達(dá)科技有限公司）;酶標(biāo)檢測儀（BioTeK Epoch公司）;IL-6、IgE、瘦素ELISA檢測試劑盒（華美生物公司）;IGF-1 ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模 40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（A組）、肥胖組（B組）、哮喘組（C組）、肥胖型哮喘組（D組），每組10只。對照組、哮喘組給予常規(guī)飼料，肥胖組、肥胖型哮喘組給予高脂飼料，喂養(yǎng)8周。以第8周末作為第0天，在第1、7、14天給予哮喘組、肥胖型哮喘組小鼠腹腔注射OVA混懸液0.2 mL（含OVA 50 μg，氫氧化鋁凝1 mg），第21天將小鼠置多功能誘咳引喘儀中，霧化吸入10 g/L OVA，連續(xù)霧化吸入3周，前7 d每天1次，然后改為隔日1次，每次0.5 h。對照組、肥胖組給予腹腔注射和霧化吸入等量的生理鹽水。

1.2.2 小鼠體質(zhì)量檢測 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，稱體質(zhì)量。喂養(yǎng)8周后，再次稱體質(zhì)量。

1.2.3 標(biāo)本采集 最后一次霧化結(jié)束后，腹腔注射100 g/L的水合氯醛0.2 mL麻醉小鼠，眼球后取血1 mL，靜置1 h，離心機離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），留取血清。結(jié)扎右肺門，用無菌注射器以0.4 mL生理鹽水緩慢灌洗左肺4次，收集肺泡灌洗液（BALF），應(yīng)用離心機離心（4 ℃，3 000 r/min，10 min），留取沉淀和上清液。取小鼠肺組織，剪碎，液氮下研磨成組織勻漿。將上述收集到的標(biāo)本置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 BALF白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù) 沉淀用100 μL PBS重懸，取50 μL滴于載玻片，高倍光鏡下使用計數(shù)板計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。涂片，瑞氏染色，計數(shù)至少200個白細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)計算各分類細(xì)胞數(shù)目和比例。

1.2.5 Real-time PCR（RT-PCR）檢測肺組織黏蛋白5AC（MUC5AC）mRNA的表達(dá) 應(yīng)用Trizol法提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存。通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索小鼠MUC5AC的mRNA序列，以GAPDH為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程有限公司提供。所用引物及其序列見表1。行RT-PCR反應(yīng)。MUC5AC mRNA的相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.2.6 血清IGF-1和瘦素水平檢測 應(yīng)用ELISA檢測試劑盒，按說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測血清IGF-1、瘦素水平。

1.2.7 BALF中IGF-1、IL-6和IgE水平檢測 應(yīng)用ELISA檢測試劑盒，按說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測BALF中IGF-1、IL-6和IgE水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以±s形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson積矩相關(guān)分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較

各組小鼠飼養(yǎng)1周的體質(zhì)量差異無顯著意義（Pgt;0.05）。飼養(yǎng)8周后，肥胖組和肥胖型哮喘組小鼠的體質(zhì)量大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 585.6，Plt;0.05）;肥胖組與肥胖型哮喘組比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。高脂飲食小鼠的體質(zhì)量超過普通飲食大鼠的20%，達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)[5]。見表2。

2.2 各組小鼠哮喘急性發(fā)作癥狀比較

在最后一次霧化吸入過程中，肥胖型哮喘組10只小鼠和哮喘組7只小鼠呼吸加深加快、躁動不安，在霧化箱里活動十分活躍，偶有大小便增加等急性發(fā)作癥狀;其中4只肥胖型哮喘小鼠甚至出現(xiàn)呼吸減慢、行動遲緩、大小便失禁現(xiàn)象。對照組和肥胖組小鼠呼吸頻率、行為、飲水飲食以及大小便等未出現(xiàn)類似表現(xiàn)。實驗過程中40只小鼠均無死亡。

2.3 各組BALF白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)比較

肥胖型哮喘組、哮喘組和肥胖組BALF的白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞高于對照組哮喘組低于肥胖型哮喘組，差異有顯著意義（F=201.7～3 447.3，Plt;0.05）。肥胖型哮喘組和哮喘組的單核粒細(xì)胞數(shù)低于對照組和肥胖組，差異有顯著性（F=1 622.3，Plt;0.05）。見表3。

2.4 各組肺組織MUC5AC mRNA表達(dá)比較

對照組、肥胖組、哮喘組以及肥胖型哮喘組的MUC5AC mRNA表達(dá)分別25.14±1.14、27.53±0.77、48.96±2.42、84.15±3.21。肥胖組、哮喘組以及肥胖型哮喘組的MUC5AC mRNA表達(dá)均較對照組升高，肥胖型哮喘組較哮喘組升高，差異有顯著性（F=1 651.6，Plt;0.05）。

2.5 各組小鼠血清IGF-1、瘦素水平比較

肥胖型哮喘組、哮喘組和肥胖組血清IGF-1、瘦素均高于對照組，且肥胖型哮喘組較哮喘組高，差異有顯著性（F=271.1、418.2，Plt;0.05）。見表4。

2.6 各組BALF中IGF-1、IL-6、IgE水平比較

肥胖型哮喘組、哮喘組和肥胖組BALF中IGF-1、IL-6、IgE水平均較對照組明顯升高，肥胖型哮喘組較哮喘組升高，差異有顯著性（F=119.3～962.9，Plt;0.05）。見表5。

2.7 小鼠血清和BALF中各指標(biāo)相關(guān)性

小鼠血清中IGF-1水平與瘦素呈正相關(guān)（r=0.889，Plt;0.05），BALF中IGF-1與IL-6、IgE也呈正相關(guān)（r=0.940、0.905，Plt;0.05）。

3 討 "論

關(guān)于體質(zhì)量指數(shù)（BMI）與哮喘相關(guān)性的薈萃分析顯示，肥胖會使哮喘發(fā)病風(fēng)險增加[6]。肥胖對哮喘的影響有兩個方面：①機械性因素，肥胖可以導(dǎo)致呼吸運動受限;②由于脂肪組織中促炎性遞質(zhì)增加，加重氣道炎癥和重塑[7]。氣道慢性黏液高分泌是哮喘的重要病理生理特征。MUC5AC是人氣道中主要的黏蛋白，在哮喘病人中過量表達(dá)[8]。本研究結(jié)果顯示，肥胖型哮喘組、哮喘組和肥胖組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和肺組織MUC5AC mRNA表達(dá)高于對照組，提示肥胖是一種慢性炎癥狀態(tài)。

本文結(jié)果顯示，肥胖型哮喘組、哮喘組和肥胖組小鼠血清和BALF中的IGF-1水平高于對照組，肥胖型哮喘組高于哮喘組。IGF是由70多個氨基酸殘基組成的多肽樣生長因子，約有65%的結(jié)構(gòu)與胰島素同源。研究結(jié)果顯示，肥胖病人的血清IGF-1水平較高。IGF-1是哮喘病人氣道炎癥和重塑的重要介體[9]。IGF-1的大部分作用是通過IGF-1受體（IGF-1R）介導(dǎo)的，IGF-1R與IGF-1結(jié)合后，通過磷酸化并誘導(dǎo)PI3K/Akt信號通路途徑促進(jìn)黏液分泌和氣道重塑[10]。本文研究結(jié)果顯示，肥胖型哮喘組小鼠白細(xì)胞總數(shù)和各分類白細(xì)胞數(shù)目、MUC5AC mRNA表達(dá)較哮喘組升高，急性發(fā)作時的癥狀較哮喘組嚴(yán)重;肥胖型哮喘組小鼠的瘦素、IL-6和IgE水平高于哮喘組，而且肥胖組的IL-6、IgE、瘦素水平均明顯高于對照組。有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖可以通過增加瘦素水平影響哮喘活動[11]。瘦素可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括腫瘤壞死因子-α、IL-6和活性氧等[12]。瘦素還可能通過JAK2-STAT3途徑調(diào)節(jié)MUC5AC的產(chǎn)生和分泌[13]。IL-6在哮喘的氣道重塑、黏液產(chǎn)生，以及免疫細(xì)胞募集、活化和增殖中發(fā)揮重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，兒童和成年哮喘病人氣道中IL-6和IL-6R升高[15]。還有研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)過長時間高脂飲食飼喂后，IL-6的信號傳導(dǎo)在全身和局部靶組織中均增強[16]。IgE在各種過敏性疾病中起關(guān)鍵作用，而且單克隆抗IgE抗體治療可顯著改善過敏性疾病的控制效果[17]。IgE主要通過與特定的高親和力受體（FcεRI）結(jié)合影響慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥和細(xì)胞的功能[18]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cεRI缺失小鼠的肥胖癥和胰島素抵抗有明顯改善[19]。過敏原可以激活氣道上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，導(dǎo)致IgE增加，加重氣道炎癥和黏液的產(chǎn)生，促進(jìn)氣道重塑。本文相關(guān)性分析顯示，IGF-1與瘦素、IL-6和IgE水平均呈正相關(guān)，提示IGF-1與瘦素、IL-6和IgE之間存在正向調(diào)節(jié)的關(guān)系。

綜上所述，IGF-1不僅可以與IGF-1R結(jié)合，直接加重氣道炎癥和黏液高分泌，而且通過與瘦素、IL-6和IgE之間正向調(diào)節(jié)的關(guān)系，進(jìn)一步影響肥胖型哮喘的氣道重塑和黏液分泌，但是其具體機制還需進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）