[摘要] 目的 研究Toll樣受體4（TLR4）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）在局部腦缺血再灌注模型腦組織中表達(dá)的變化。方法 選擇36只SD大鼠隨機(jī)分為3組，分別為假手術(shù)組（S組）、對(duì)照組（C組）和菊酯組（NF-κB抑制劑，CE組），每組12只。建立局部腦缺血再灌注的大鼠模型。采用雙盲法對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)行記錄，應(yīng)用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法評(píng)估大腦梗死體積，TUNEL染色法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)TLR4和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 C組和CE組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于S組（F=16.7～189.7，Plt;0.01）。TTC染色結(jié)果表明，C組和CE組的腦缺血程度高于S組，CE組的腦梗死體積顯著低于C組（F=271.5，Plt;0.01）。同時(shí)，CE組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于C組（F=616.9，Plt;0.01）。S組大鼠NF-κB和TLR4表達(dá)水平均顯著低于C組和CE組（F=279.7、884.8，Plt;0.01），而其在CE組大鼠表達(dá)水平顯著低于C組（Plt;0.01）。結(jié)論NF-κB和TLR4的高表達(dá)可能與腦缺血再灌注損傷具有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血;再灌注損傷;Toll樣受體4;NF-κB;大鼠，Sprague-Dawley

[中圖分類(lèi)號(hào)] R743.31;R619.9 "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A "[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）02-0212-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.063 [開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0914.006.html;2020-04-17 17：04

[ABSTRACT] Objective To study the changes in the expression of Toll-like receptor 4 （TLR4） and nuclear factor-κB （NF-κB） in the brain tissue of focal cerebral ischemia-reperfusion model. "Methods A total of 36 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group （group S）， control group （group C）， and chrysanthemum ester group （NF-κB inhibitor， group CE）， with 12 rats in each group. A rat model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established. The double-blind me-thod was used to record the neurological deficit score of rats. The 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining of the brain slices was performed to evaluate the cerebral infarct volume. TUNEL staining was carried out to label the apoptotic cells. Western blotting analysis was used to measure the expression of TLR4 and NF-κB. "Results Groups C and CE had significantly higher neurological deficit scores than group S （F=16.7-189.7，Plt;0.01）. The TTC staining results showed that groups C and CE had higher degrees of cerebral ischemia than group S， but the cerebral infarct volume in group CE was significantly lower than that in group C （F=271.5，Plt;0.01）. In addition， group CE had a significantly lower number of TUNEL positive cells than group C （F=616.9，Plt;0.01）. The Western blotting results showed that group S had significantly lower expression levels of NF-κB and TLR4 than groups C and CE （F=279.7，884.8;Plt;0.01）， and group CE had significantly lower expression levels of NF-κB and TLR4 than group C （Plt;0.01）. "Conclusion The increased expression of NF-κB and TLR4 may be related to the cerebral ischemia-reperfusion injury.

[KEY WORDS] brain ischemia; reperfusion injury; Toll-like receptor 4; NF-kappa B; rats， Sprague-Dawley

腦卒中是人類(lèi)致死的第二大病因，其嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，并且對(duì)家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-3]。臨床上，腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中，缺血性卒中占卒中發(fā)病率的80%左右[4-6]。各種原因引起的大腦供血、供氧減少可導(dǎo)致缺血性腦血管病的發(fā)生和組織的壞死，而腦缺血再灌注有時(shí)會(huì)進(jìn)一步加重卒中損害和功能紊亂。業(yè)已證實(shí)，炎癥與神經(jīng)元細(xì)胞死亡和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）在炎癥發(fā)生過(guò)程中具有關(guān)鍵作用[7]。Toll樣受體（TLR）是一種跨膜受體，而TLR4作為其中一種亞型，主要識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞分泌增加，引起全身炎癥反應(yīng)[8-9]。目前，對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路在局部腦缺血再灌注損傷中的作用還不夠明確[10]。本文通過(guò)建立大鼠缺血再灌注模型，探討缺血再灌注引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷與TLR4/NF-κB表達(dá)的關(guān)系，旨在為明確缺血再灌注損傷機(jī)制提供依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料

菊酯（NF-κB抑制劑）、水合氯醛（上海阿拉丁生物技術(shù)公司），氯化三苯基四氮唑（TTC，美國(guó)Sigma公司），大鼠ELISA試劑盒（ELC）（美國(guó)Invitrogen公司，貨號(hào)：ML-Elisa-0600），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：D2650），RIPA溶解產(chǎn)物、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（中國(guó)Service生物公司，貨號(hào)：M00620-FKB），抗TLR4抗體（Solarbio公司，貨號(hào)：K003881P），抗NF-κB抗體（美國(guó)Cayman Chemical，貨號(hào)：17493-1）。

1.2 動(dòng)物和處理

雄性SD大鼠42只，8周齡，體質(zhì)量為220～280 g，購(gòu)于江西省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證號(hào)：SCXK （Gan） 2015-0019）。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠均在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周，保證室溫（21±2）℃、濕度（50±5）%、12 h/12 h晝夜光照循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照青島市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行（KY-Y20190661）。

隨機(jī)取12只SD大鼠為假手術(shù)組（S組），其余30只參照Z(yǔ)ea-Longa線栓法經(jīng)左側(cè)頸外-內(nèi)動(dòng)脈插線建立大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型[11]。缺血2 h后，輕輕拉出線栓，實(shí)現(xiàn)缺血再灌注。術(shù)后2 h采用Zea-Longa標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[11]，>1分者視為模型成功，將不成功的6只剔除。將建模成功的24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）和菊酯組（CE組），每組12只。S組不插線，其余操作同C組和CE組。 CE組在手術(shù)前2 h腹腔內(nèi)注射2 mL 菊酯溶液（5 mg/kg），S組和CE組注射同體積生理鹽水。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 神經(jīng)行為功能評(píng)分 各組大鼠分別于腦缺血再灌注損傷后2、8、24 h采用Zea-Longa標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分[11]。0分，沒(méi)有神經(jīng)功能缺損癥狀;1分，輕度局灶性神經(jīng)功能缺損（不能完全性伸展前肢）;2分，中度局灶神經(jīng)功能缺損（行走時(shí)向健側(cè)劃圈）;3分，重度神經(jīng)功能缺損（行走時(shí)向健側(cè)傾斜）;4分，不能自主行走，意識(shí)水平下降。

1.3.2 TTC染色 缺血再灌注24 h后，每組取4只大鼠麻醉，從左心室穿刺以生理鹽水沖洗，完整取腦，放入切腦磨具中，冠狀位切片，每片約2 mm厚。每只取3張，將腦片置于20 g/L的TTC溶液中，37 ℃隔水培養(yǎng)箱中避光浸浴5 min。染色后將腦組織片置于40 g/L甲醛溶液中固定。正常腦組織在TTC溶液中被染成亮紅色，梗死區(qū)腦組織不被染色。固化24 h后照相，采用圖像處理軟件測(cè)量腦組織片各面缺血所占切片總面積的百分比。

1.3.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定 每組取4只大鼠，取腦置于液氮、-80 ℃保存，連續(xù)冠狀位切片，厚度10 μm，每隔5張抽取1張，每只取3張，貼片，晾干。按照TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用PBS緩沖液沖洗5 min。用10 g/L的Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）漂洗腦組織15 min，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。在100 mmol/L氨基乙酸中孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。加入TUNEL反應(yīng)液，在暗濕盒中37 ℃孵育1 h，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min。加入DAPI 孵育10 min，用超純水沖洗3次，每次5 min。最后封片，于4 ℃暗室中在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照。具有黃綠色熒光的為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。

1.3.4 TLR4和NF-κB蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)。每組取4只大鼠，每只取腦組織標(biāo)本100 mg，按蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。于蛋白樣本加入1/4體積5×SDS上樣緩沖液，以50 μg蛋白樣品用于SDS-PAGE凝膠電泳，200 mA恒電流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。TBS/T洗膜后用50 g/L的BSA封閉2 h，再以TBS/T洗膜后加入相應(yīng)濃度的抗體（抗TLR4抗體、抗NF-κB抗體），室溫下以側(cè)搖擺床緩慢搖動(dòng)孵育2 h，并4 ℃孵育過(guò)夜，最后以TBS/T洗膜加入二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。TBS/T洗膜后用ECL發(fā)光液顯色成像。應(yīng)用Image J軟件比較目的條帶相對(duì)灰度值。每只實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，TTC染色結(jié)果、凋亡細(xì)胞水平及蛋白表達(dá)均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多組間不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損評(píng)分均數(shù)的比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，多組間均數(shù)的兩兩均數(shù)比較采用Bonferroni方法。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

缺血再灌注8、24 h后C組和CE組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均顯著高于S組，而CE組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分又顯著低于C組，差異均有顯著意義（F=16.7～189.7，Plt;0.01）。說(shuō)明給予菊酯抑制NF-κB后大鼠缺血再灌注損傷減小。見(jiàn)表1。

2.2 各組腦組織切片TTC染色比較

缺血再灌注24 h后，S組、C組和CE組的梗死區(qū)域分別為（6.32±2.76）%、（41.46±4.52）%和（29.51±3.78）%，S組的梗死區(qū)域明顯小于C組和CE組，而CE組的壞死區(qū)域則顯著小于C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=271.5，Plt;05）。說(shuō)明給予菊酯抑制NF-κB后，大鼠局部腦組織梗死區(qū)域面積明顯縮小。見(jiàn)圖1A。

2.3 各組腦組織切片神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平比較

腦缺血再灌注24 h后，S組、C組和CE組的 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞分別為23.21±5.82、385.42±26.42和204.02±35.73。S組少見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，C組和CE組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于S組（F=616.9，Plt;0.001）。與C組大鼠比較，CE組大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)果提示給予菊酯抑制NF-κB后，局部腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯下降。見(jiàn)圖1B～D。

2.4 各組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)比較

Western blot結(jié)果表明，缺血再灌注24 h后， C組和CE組大鼠的TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于S組（F=279.7、884.4，Plt;0.01）。同時(shí)，TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)在CE組明顯低于C組（Plt;0.05）。提示菊酯可明顯抑制NF-κB表達(dá)，通過(guò)控制NF-κB/TLR4信號(hào)通路降低腦組織的缺血再灌注損傷。見(jiàn)圖2A～C。

3 討 "論

缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制是腦血流中斷，能量代謝紊亂，離子水平失衡，自由基和興奮性神經(jīng)毒性物質(zhì)產(chǎn)生[12]。TLR4廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以識(shí)別由于缺血再灌注損傷所釋放的內(nèi)源性配體，其可引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[13-14]?；罨腘F-κB可誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)，其相應(yīng)的受體在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。NF-κB/TLR4信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中介導(dǎo)多種炎癥遞質(zhì)和金屬蛋白酶的產(chǎn)生和釋放，因此，控制NF-κB/TLR4信號(hào)通路可降低腦組織的缺血再灌注損傷[16-21]。

本研究通過(guò)建立大鼠腦局部缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，觀察TLR4和NF-κB在神經(jīng)損傷中的變化。通過(guò)應(yīng)用菊酯抑制NF-κB表達(dá)，從而明確NF-κB是否在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用。本文結(jié)果顯示，C組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于S組，這就說(shuō)明缺血再灌注可嚴(yán)重破壞大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)功能。另外，CE組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于C組，表明NF-κB抑制劑對(duì)大鼠神經(jīng)功能具有保護(hù)作用。本文采用TTC和TUNEL染色從形態(tài)學(xué)和凋亡細(xì)胞水平評(píng)價(jià)缺血再灌注對(duì)腦組織的損害。結(jié)果顯示，缺血再灌注能明顯增加腦梗死面積，提高腦組織中凋亡細(xì)胞水平。而菊酯干預(yù)則能顯著降低腦梗死面積和細(xì)胞凋亡水平，對(duì)抗缺血再灌注損傷，對(duì)大鼠腦組織起到保護(hù)作用。既往的研究結(jié)果顯示，腦梗死病人TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)較健康人明顯升高，并且與腦血流量具有相關(guān)性[22-24]。我們通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腦組織NF-κB和TLR4蛋白表達(dá)的結(jié)果表明，C組NF-κB和TLR4蛋白表達(dá)顯著高于S組，而兩者在CE組的表達(dá)又明顯低于C組。這說(shuō)明缺血再灌注損害會(huì)提高腦組織NF-κB和TLR4的表達(dá)，而活化的NF-κB信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致腦組織損傷。這是因?yàn)槟X局部缺血再灌注損傷中的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)能提高NF-κB的表達(dá)，激活NF-κB信號(hào)通路，促使NF-κB從p50同源二聚體轉(zhuǎn)化成具有轉(zhuǎn)錄活性的p60異二聚體。而活化的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生一系列炎癥因子，促進(jìn)炎癥發(fā)生。此外，NF-κB p65/p50水平增高也表明NF-κB信號(hào)通路的活化，進(jìn)一步導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放。上述原因?qū)е碌难装Y反應(yīng)引起腦組織中凋亡細(xì)胞水平升高，神經(jīng)功能受損。腦損傷產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)作為T(mén)LR4配體，可以增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[25-29]。本文的研究結(jié)果還顯示，與C組比較，CE組NF-κB水平明顯下降，更進(jìn)一步證明NF-κB在腦缺血再灌注損傷中的作用。

既往對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路在腦血管病中的作用研究多為對(duì)缺血性模型的研究，而對(duì)缺血再灌注模型研究較少。而缺血再灌注損傷也是影響病人治療效果及預(yù)后的一項(xiàng)重要因素。本文通過(guò)腦缺血再灌注損傷的大鼠模型證實(shí)，腦缺血再灌注損傷能夠提高TLR4和NF-κB的表達(dá)，激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響神經(jīng)功能。通過(guò)抑制NF-κB可降低TLR4的表達(dá)，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活，在局部腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。這為進(jìn)一步研究缺血性腦梗死發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了一定理論基礎(chǔ)，并且有可能為進(jìn)一步研究缺血性腦血管病的治療方法提供參考。本研究仍存在一些不足，今后的研究中將進(jìn)一步增加缺血組和缺血再灌注組的比較，以進(jìn)一步明確TLR4/NF-κB信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。

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