[摘要] 目的 利用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（LAMP）芯片法對疑似下呼吸道感染病人進(jìn)行13種病原體檢測，評價該方法的臨床應(yīng)用價值。方法 收集2017年就診于我院的疑似下呼吸道感染病人的深部痰液標(biāo)本2 029例及肺泡灌洗液標(biāo)本246例，分別采用LAMP芯片法和分離培養(yǎng)技術(shù)對病原體進(jìn)行檢測。以培養(yǎng)法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對LAMP芯片法進(jìn)行方法學(xué)評價。結(jié)果 在深部痰液標(biāo)本中，LAMP芯片法和普通培養(yǎng)法檢測的總陽性率分別為57.96%（1 176/2 029）和10.50%（213/2 029），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=101.511，P<0.01）;兩種方法對銅綠假單胞菌的檢出一致性最高（Kappa=0.651，95%CI=0.561～0.741）。痰液標(biāo)本中流感嗜血桿菌的檢出率最高，為21.24%（431/2 029）。深部痰液和肺泡灌洗液檢出的病原體種類及陽性率均存在明顯差異。結(jié)論 LAMP芯片法可對下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原體，尤其是苛養(yǎng)菌和不可培養(yǎng)病原體進(jìn)行快速檢測，其檢出陽性率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且其檢測快速可靠，適于在基層醫(yī)院中推廣。

[關(guān)鍵詞] 呼吸道感染;病原;核酸擴(kuò)增技術(shù);芯片分析技術(shù)

[中圖分類號] R446.5;R517.6 "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A "[文章編號] 2096-5532（2020）02-0207-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.053 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200325.1005.005.html;2020-03-026 11：30

[ABSTRACT] Objective To evaluate the clinical value of the on-chip loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay by testing patients with suspected lower respiratory tract infection （LRTI） for 13 pathogens using the LAMP assay. "MethodsA total of 2 029 deep sputum specimens and 246 bronchoalveolar lavage fluid （BALF） specimens were collected from patients with suspected LRTI who attended our hospital in 2017. The patients were tested for pathogens using the on-chip LAMP assay and pathogen isolation and culture technique. The methodology of the on-chip LAMP assay was evaluated using the pathogen culture method as the “gold standard”. "Results The overall positive rates of the on-chip LAMP assay and conventional culture method in sputum specimens were 57.96% （1 176/2 029） and 10.50% （213/2 029）， respectively， with a significant difference observed between the two methods （χ2=101.511，Plt;0.01）. The two methods had the highest detection consistency for Pseudomonas aeruginosa （Kappa=0.651，95% confidence interval： 0.561-0.741）. The detection rate of Haemophilus influenzae in sputum specimens was highest （21.24%，431/2 029）. There were significant differences in the type and positive rate of pathogens between deep sputum and BALF specimens. "Conclusion The on-chip LAMP assay can be used for rapid detection of pathogens in sputum and BALF specimens collected from patients with LRTI， especially the fastidious bacteria and non-culturable pathogens， the positive detection rate for which is significantly higher than that with conventional culture method. The LAMP assay is fast and reliable， which makes it suitable for application in primary hospitals.

[KEY WORDS] respiratory tract infections; noxae; nucleic acid amplification techniques; microchip analytical procedures

下呼吸道感染是臨床常見的呼吸系統(tǒng)嚴(yán)重的感染性疾病，是目前導(dǎo)致人類死亡的四大主要原因之一[1]，不能及時獲得正確的診斷和治療是導(dǎo)致其病死率居高不下的主要原因。傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)法是診斷下呼吸道感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其存在培養(yǎng)時間長、敏感性低、對苛養(yǎng)菌漏檢率高等缺陷[2]，不能滿足臨床對感染的快速診斷需要。近年來生化及免疫學(xué)檢驗領(lǐng)域的發(fā)展對下呼吸道感染性疾病的快速診斷起到了良好的推動作用，但這些檢查方法仍存在敏感性低和特異性不高等缺點[3]。分子生物學(xué)技術(shù)因高效、特異和敏感等特性已被廣泛應(yīng)用于臨床對多種疾病的診斷中。作為分子生物學(xué)技術(shù)的代表性方法，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)可快速鑒定病原體，且多重PCR技術(shù)可以對多種病原體同時進(jìn)行篩檢[4]。然而，PCR檢測需要分子生物學(xué)實驗室配備高度精密的儀器，價格昂貴，而且操作復(fù)雜。近年來出現(xiàn)的一種新的核酸檢測方法——環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增（LAMP）芯片法，可同時檢測13種病原體，其特異性強、敏感性高，檢測快速準(zhǔn)確、操作簡單，對技術(shù)水平要求相對較低，所需實驗器材簡單，被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷中。本研究旨在通過對疑似下呼吸道感染病人的深部痰液及肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行LAMP檢測，評價該方法的臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其來源

研究對象為2017年1—12月在我院就診的疑似下呼吸道感染病人2 029例。病人均來源于煙臺和威海地區(qū)，其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽咳痰，伴或不伴胸痛及呼吸困難，查體呼吸音粗糙，伴或不伴干/濕性啰音，胸部X線片或胸部CT掃描等影像學(xué)檢查提示下呼吸道感染。其中，男性1 179例，女性850例;年齡0～97歲。收集2 029例病人自然咳出的深部痰液標(biāo)本和246例病人的肺泡灌洗液標(biāo)本。痰液標(biāo)本的合格標(biāo)準(zhǔn)：多形核白細(xì)胞>25/低倍鏡視野（LP），鱗狀上皮細(xì)胞<100/LP。肺泡灌洗液標(biāo)本的合格標(biāo)準(zhǔn)：<1%的細(xì)胞為鱗狀上皮細(xì)胞。

1.2 試劑及儀器

LAMP芯片法試劑盒及RTisochipTM-A恒溫擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀均購自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司;病原體分離培養(yǎng)所用的試劑及VITEKⅡ-Compact細(xì)菌鑒定儀均購自法國梅里埃生物公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 LAMP芯片法 ①核酸提?。禾狄航?jīng)40 g/L的NaOH溶液充分消化，振蕩混勻后室溫下靜置20 min，以13 000 r/min離心5 min，棄上清，向沉淀中加入核酸提取液并吹打混勻。將懸液轉(zhuǎn)移入核酸提取管中，加入玻璃珠，振蕩20 min后于95 ℃金屬浴放置5 min，離心。②配制核酸反應(yīng)體系：從冰箱中取出恒溫擴(kuò)增試劑在室溫下解凍，輕搖充分混勻后瞬時離心至試劑管管底。吸取20.0 μL恒溫擴(kuò)增試劑，加入34.5 μL被檢核酸樣品，每份核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為54.5 μL。③芯片加樣：打開RTisochipTM-A恒溫擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀，吸取50 μL上述配制好的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系，加入到芯片主通道中后運行儀器，結(jié)果用相應(yīng)軟件進(jìn)行分析。④結(jié)果判讀：每次實驗分別設(shè)置陰性和陽性對照，實驗結(jié)果以熒光曲線形式體現(xiàn)，其中擴(kuò)增曲線呈“S”型即判定為陽性，擴(kuò)增曲線呈水平直線者即判定為陰性。

1.3.2 病原體分離培養(yǎng) 接種培養(yǎng)及菌種鑒定遵循呼吸道病原微生物操作標(biāo)準(zhǔn)（WS/T499-2017）進(jìn)行，培養(yǎng)后取可疑菌落使用法國梅里埃VITEKII-Compact全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用卡方檢驗;兩種方法檢測結(jié)果的一致性分析采用Kappa分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 LAMP芯片法陽性檢出率

在痰液標(biāo)本中，LAMP芯片法檢測的總陽性率為57.96%（1 176/2 029）。檢出病原體以流感嗜血桿菌為主，陽性率為21.24%（431/2 029）;其次為肺炎鏈球菌以及肺炎支原體，陽性率分別為16.46%（334/2 029）和14.14%（287/2 029）;鮑曼不動桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、結(jié)核分支桿菌復(fù)合群、肺炎衣原體陽性率均較低。在肺泡灌洗液標(biāo)本中，LAMP芯片法檢測的總陽性率為33.33%（82/246）。檢出病原體以肺炎支原體為主，陽性率為20.73%（51/246）;其次為肺炎鏈球菌、結(jié)核分支桿菌復(fù)合群、銅綠假單胞菌，陽性率分別為6.91%（17/246）、4.88%（12/246）、4.77%（11/246）;其他病原體陽性率均較低。不同類型標(biāo)本呼吸道病原體陽性率存在差異。見表1。

2.2 不同性別病人LAMP芯片法檢測陽性率比較

在痰液標(biāo)本中，男性和女性病人檢出病原體均以流感嗜血桿菌為主，差異無顯著性（P>0.05）;女性病人肺炎支原體陽性率顯著高于男性病人（χ2=10.228，P<0.05），而肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌陽性率顯著低于男性（χ2=5.558、6.247，P<0.05）。見表2。

2.3 不同年齡病人LAMP芯片法檢測陽性率比較

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2016年年齡分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，將病人分為少年組（<18歲）、青年組（18～44歲）、中年組（45～59歲）和老年組（>59歲）。不同年齡組病人痰液標(biāo)本LAMP芯片法檢測陽性率比較見表3。由表3可知，各年齡組間比較，流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體檢測陽性率少年組高于其他年齡組，金黃色葡萄球菌、結(jié)核分支桿菌復(fù)合群檢測陽性率以青年組最高，肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及嗜麥芽窄食單胞菌檢測陽性率隨年齡的增大而增高，大腸埃希菌檢測陽性率老年組高于其他組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.445～148.189，P<0.05）。流感嗜血桿菌陽性率在各年齡組均較高。

2.4 兩種方法檢測結(jié)果的一致性分析

在痰液標(biāo)本中，普通培養(yǎng)法檢測的總陽性率為10.50%（213/2 029），與LAMP芯片法比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=101.511，P<0.01）。LAMP芯片法與培養(yǎng)法檢出病原體共同陽性174例，LAMP芯片法檢出陽性而培養(yǎng)法陰性1 559例，兩種方法檢測結(jié)果一致性見表4。在13種病原體中，兩種方法檢出銅綠假單胞菌的一致性最高（Kappa=0.651，95%CI=0.561～0.741）。

3 討 "論

下呼吸道感染是一個全球范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，它常為多種呼吸系統(tǒng)疾病的誘因，并涉及種類繁多的病原體。目前，在短時間內(nèi)做出明確的病原學(xué)診斷并進(jìn)行有針對性的治療依然很困難，這也是該病死亡率高的主要原因[6]。實踐證明，定期或者不定期地對呼吸道疾病的流行病學(xué)特征進(jìn)行統(tǒng)計分析，可以為疾病預(yù)防控制提供干預(yù)依據(jù)[7]。預(yù)防為主、準(zhǔn)確診斷、及時治療，是防治該病的基本原則，而明確引起感染的病原體和針對性藥物的選擇配伍則是降低該病死亡率的重要保證。下呼吸道感染多由細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等病原體引起[8]，受目前技術(shù)所限，除細(xì)菌外的其他病原體的常規(guī)培養(yǎng)，臨床微生物室尚難以開展。因此，一種特異性高、覆蓋面廣、檢測靈敏快速的病原體診斷方法——LAMP技術(shù)應(yīng)運而生。

2000年，這種以鏈置換酶核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的LAMP被NOTOMI等[9]首次報道。LAMP利用針對6個靶基因區(qū)域而設(shè)計的4對特異性引物，通過鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下（65 ℃左右），形成一系列不同大小的具有多個靶DNA反向重復(fù)串聯(lián)序列的產(chǎn)物。該方法不需要傳統(tǒng)PCR的嚴(yán)苛條件和觀察步驟，整個反應(yīng)過程僅需15～60 min即可完成[10]。LAMP從標(biāo)本處理到報告結(jié)果全過程僅需2 h，尤其適用于基層醫(yī)院及軍隊野戰(zhàn)醫(yī)院，故一經(jīng)報道就受到了廣泛的關(guān)注[11]。LAMP的特異性和敏感性很高，操作及檢測方法簡單，且芯片法檢測結(jié)果不易出現(xiàn)污染、自動化程度高、試劑損耗低、檢測病原體覆蓋面廣，具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力[12]。

本研究以商品化LAMP試劑盒對疑似下呼吸道感染病人的標(biāo)本進(jìn)行了13種病原體的檢測，結(jié)果表明，流感嗜血桿菌是最主要下呼吸道致病菌，其次為肺炎鏈球菌和肺炎支原體，該結(jié)果與我院同期微生物室呼吸道標(biāo)本分離細(xì)菌分布情況大致相同，但與同年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的數(shù)據(jù)略有差異。這可能與地域差異有關(guān);另外，由于流感嗜血桿菌對環(huán)境的要求較為嚴(yán)格，采集及運輸方式不當(dāng)，對培養(yǎng)陽性率的影響也較大[13]。本研究中，女性病人肺炎支原體的陽性率較男性高，而男性病人肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌的陽性率高于女性。這可能與女性和男性的生理及免疫差異有關(guān)，具體機制尚需進(jìn)一步研究。各年齡組間比較，8種下呼吸道病原體陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示下呼吸道病原體感染與年齡有一定的關(guān)系。這與鄭才玲等[14]的報道較為一致。流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體的陽性率在少年組最高，這與少年人群免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，且長期活動于學(xué)校等人群密集度較高的場所，呼吸道病原體的傳播更容易且迅速，從而導(dǎo)致相關(guān)病原體陽性檢出率偏高[15]。肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌陽性率則在老年組最高，這與老年病人基礎(chǔ)疾病多、住院率高、院內(nèi)感染率高有關(guān)。深部痰液和肺泡灌洗液檢出的病原體種類及陽性率均存在明顯差異，肺泡灌洗液中流感嗜血桿菌的檢出率較低，而肺炎支原體的檢出率較高。這可能是由于不同病原體的定植位置不同而導(dǎo)致的，肺炎支原體常黏附于肺泡上皮細(xì)胞上，通過肺泡灌洗后能于灌洗液中富集，因此檢出率會更高[16];而流感嗜血桿菌等常定植于上呼吸道，因此通過自然咳痰的方法更易被檢出[17]。

LAMP芯片法對某些苛養(yǎng)菌（如肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等）的檢出率比常規(guī)培養(yǎng)法更高，對支原體等難以常規(guī)培養(yǎng)的病原體更有培養(yǎng)法所無法比擬的優(yōu)勢。由于抗生素的廣泛使用，很多病人在留取標(biāo)本前可能已經(jīng)使用了某些抗生素，這會對培養(yǎng)的陽性率造成嚴(yán)重影響;另外，某些病原體對培養(yǎng)條件要求苛刻，需要特殊的培養(yǎng)基才能生長，培養(yǎng)困難或根本無法培養(yǎng)，這也是造成培養(yǎng)陽性率低的一大因素。如流感嗜血桿菌培養(yǎng)條件特殊，X因子（正鐵血紅素）、V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）是其生長的必須因子，臨床分離、培養(yǎng)時巧克力平板的V因子在常溫或高溫下容易失去活性，導(dǎo)致流感嗜血桿菌在培養(yǎng)基上生長差或不生長，經(jīng)常被漏檢[18]。肺炎鏈球菌在體外生存能力較弱，對培養(yǎng)的營養(yǎng)要求高，可產(chǎn)生自溶酶，在經(jīng)驗不足的基層實驗室中使用普通培養(yǎng)基或涂片革蘭染色檢查可將其與草綠色鏈球菌混淆，培養(yǎng)和菌種菌型鑒別過程復(fù)雜，導(dǎo)致培養(yǎng)法陽性率較低[19]。LAMP技術(shù)可從標(biāo)本極其微量的核酸中獲取目的基因[20]，并進(jìn)行擴(kuò)增和放大，靈敏度較普通培養(yǎng)法有質(zhì)的提高。本研究結(jié)果還顯示，兩種方法的診斷一致性較好，尤其是對銅綠假單胞菌的檢出一致性最高，Kappa值可達(dá)0.651。由于嬰幼兒的依從性較差，合格的痰培養(yǎng)標(biāo)本難以獲取，因此病原體陽性檢出率低是困擾嬰幼兒下呼吸道感染診斷的關(guān)鍵問題[21]。LAMP技術(shù)由于采用了特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，在保證了高度特異性的前提下[22]，大大提高了檢出陽性率，這使得該技術(shù)在嬰幼兒下呼吸道感染病原體診斷方面具有絕對的優(yōu)勢。LAMP芯片法還可對結(jié)核分支桿菌復(fù)合群、軍團(tuán)菌[23]、衣原體這3種無法常規(guī)培養(yǎng)的病原體同時進(jìn)行檢測，可使病原體的覆蓋面更廣，大大提高了診斷的靈敏度[24]。本研究中檢出軍團(tuán)菌4例，結(jié)核分支桿菌復(fù)合群28例，衣原體10例。28例結(jié)核分支桿菌復(fù)合群中，17例抗酸桿菌涂片陰性，我們又對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序驗證，符合率100%，病人抗結(jié)核治療有效。表明LAMP芯片法可以幫助臨床快速診斷下呼吸道感染并指導(dǎo)臨床合理用藥。

綜上所述，本研究采用LAMP芯片法檢測了本地區(qū)疑似下呼吸道感染病人的病原體分布情況，結(jié)果顯示病原體以流感嗜血桿菌為主，與同期全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的數(shù)據(jù)略有差異;該方法可對下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原體，尤其是苛養(yǎng)菌和不可培養(yǎng)病原體進(jìn)行快速檢測，檢出陽性率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。LAMP芯片法操作簡單，可同時檢測多種病原體，適宜在基層醫(yī)院中推廣和應(yīng)用。

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（本文編輯 馬偉平）