[摘要] 目的 探討細(xì)胞集落刺激因子1受體（CSF1R）抑制劑PLX5622對(duì)C57BL/6小鼠空間型學(xué)習(xí)與記憶的影響。方法 16只健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各8只。實(shí)驗(yàn)組小鼠連續(xù)2周投食含PLX5622的鼠糧，對(duì)照組小鼠投食等量的標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組小鼠的空間型學(xué)習(xí)力與記憶力;應(yīng)用熒光免疫組化法測(cè)定兩組小鼠海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的密度。結(jié)果 水迷宮結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在圓臺(tái)所在象限探索的時(shí)長(zhǎng)百分比明顯下降（t=3.556，Plt;0.01），逃避潛伏期、穿越圓臺(tái)次數(shù)、游泳速度差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。熒光免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠每平方毫米海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（t=11.430，Plt;0.01），成熟神經(jīng)元數(shù)量?jī)山M比較差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。結(jié)論 海馬區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞清除不影響小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶獲取，但削弱小鼠的空間型記憶力。

[關(guān)鍵詞] 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;迷宮學(xué)習(xí);海馬;小鼠

[中圖分類號(hào)] R338.2 "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A "[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）02-0173-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.089 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1430.004.html;2020-05-20 08：57

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the colony-stimulating factor 1 receptor inhibitor PLX5622 on the spatial learning and memory in C57BL/6 mice. "Methods A total of 16 healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into control group and experimental group， with 8 mice in each group. The mice in the experimental group were given PLX5622-based chow diet for 2 consecutive weeks， and those in the control group were given an equivalent amount of normal chow diet. Morris water maze test was conducted to evaluate the spatial learning and memory of the mice. Fluorescent immunohistochemistry was used to determine the density of microglial cells in the hippocampus of the mice. "Results Morris water maze test showed that the searching time （%） for the platform in the target quadrant was significantly reduced in the experimental group compared with that in the control group （t=3.556，Plt;0.01）， while the escape latency， number of platform crossings， and swimming speed were not significantly different between the two groups （Pgt;0.05）. Fluorescent immunohistochemistry showed that the number of microglial cells per square millimeter of the hippocampus was significantly reduced in the experimental group compared with that in the control group （t=11.430，Plt;0.01）， while the number of mature neurons was not significantly different between the two groups （Pgt;0.05）. "Conclusion Microglial cell elimination in the hippocampus has no significant effect on spatial learning and memory acquisition in mice， but it reduces the spatial memory of the mice.

[KEY WORDS] microglia; maze learning; hippocampus; mice

越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，神經(jīng)炎癥和多種神經(jīng)退變性疾?。ㄈ绨柶澓ＤY和帕金森病等）的發(fā)生相關(guān)度很大[1-4]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)并發(fā)炎癥的一個(gè)重要的參與者[5-6]。在健康的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞可以維持大腦的微環(huán)境平衡，保護(hù)其神經(jīng)元;中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷或感染時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)性激活即M1極化，高表達(dá)炎性細(xì)胞因子，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，吞噬細(xì)胞碎片，利于損傷修復(fù);而過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞則引起促炎性細(xì)胞因子大量增加，誘導(dǎo)慢性炎癥并導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[7-12]。集落刺激因子1受體（CSF1R）抑制劑PLX5622，可以阻斷血小板衍生的生長(zhǎng)因子家族配體CSF1與單核類細(xì)胞和外周巨噬細(xì)胞型細(xì)胞特異的酪氨酸激酶型受體CSF1R的結(jié)合，從而清除腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞。PLX5622不影響小鼠日常活動(dòng)，在停用該藥物1周后，腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞基本恢復(fù)正常水準(zhǔn)[12-15]。為了探究小膠質(zhì)細(xì)胞的消除是否影響小鼠的學(xué)習(xí)與記憶，本研究采取PLX5622喂食清除小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞[16]，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的清除對(duì)正常的野生型小鼠空間型學(xué)習(xí)與記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)12周齡的雄性C57BL/6小鼠16只，體質(zhì)量（30±2）g，由北京維通-利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司供應(yīng)。小鼠于20 ℃、日夜循環(huán)光照狀態(tài)下喂養(yǎng)，可隨意進(jìn)食、飲水、活動(dòng)。隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照鼠糧喂食組（對(duì)照組）、PLX5622鼠糧喂食組（實(shí)驗(yàn)組），各8只。PLX5622鼠糧（每千克含PLX5622量為1 200 mg）和對(duì)照鼠糧（不含PLX5622，其余成分與實(shí)驗(yàn)組一致）購(gòu)自Plexxikon公司。

1.2 給藥方法

實(shí)驗(yàn)開始前14 d啟動(dòng) PLX5622 喂食或?qū)φ瘴故?，并在?shí)驗(yàn)期間維持。喂食期間小鼠單籠飼養(yǎng)并每天撫慰2 min以降低其焦慮水平[15]。小鼠每天定點(diǎn)定量喂食（每只4 g/d），同時(shí)記錄食用量。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮包括裝有水的圓柱狀水箱、隱匿在水平面下的圓臺(tái)以及一系列視頻主動(dòng)拍攝和處理數(shù)據(jù)系統(tǒng)，可以用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的空間型學(xué)習(xí)與記憶能力。每只小鼠每天進(jìn)行4次空間定位游泳訓(xùn)練，記下小鼠每天尋找水下圓臺(tái)的逃避潛伏期，評(píng)價(jià)小鼠的空間型學(xué)習(xí)能力[17]。連續(xù)訓(xùn)練6 d后進(jìn)行為期60 s的空間型記憶測(cè)試，記錄小鼠穿過(guò)圓臺(tái)次數(shù)、象限探索時(shí)長(zhǎng)的百分比、游泳速度等，以評(píng)價(jià)小鼠的空間型記憶[18]。

1.4 熒光免疫組化檢測(cè)

水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后，兩組小鼠以40 g/L多聚合甲醛經(jīng)心灌注后取腦，固定4 h，放入含有300 g/L蔗糖的混合液中沉糖。用包埋劑OCT包住腦組織，快速冷凍、切片，切片厚度40 μm。將切片移到0.01 mol/L PBS混合液中保存。行常規(guī)熒光免疫組化檢測(cè)：腦切片以0.01 mol/L PBS混合液洗凈后，加抗體封閉液在常溫?fù)u床上封閉1 h，然后加一抗4 ℃搖床上孵育72 h;以0.01 mol/L PBS混合液清洗3次后，加熒光二抗在常溫?fù)u床上孵育1～2 h（暗光下）;再以0.01 mol/L PBS混合液洗清干凈后，將切片轉(zhuǎn)移到載玻片上鋪片、晾干，封片劑封片。應(yīng)用Leica DMi8倒置熒光顯微鏡和10倍干物鏡捕獲熒光圖像，Image J圖像閾值測(cè)量工具對(duì)擇定海馬腦域（ROI）小膠質(zhì)細(xì)胞染色密度進(jìn)行量化分析。所用一抗NeuN抗體（1∶1 000）和Iba1抗體（1∶500）均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，熒光二抗Alexa-568 goat anti-mouse IgG（1∶2 000）和Alexa-488 goat anti-rabbit IgG（1∶2 000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graph Pad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s表示，兩組比較采取成組t檢驗(yàn);多組數(shù)據(jù)比較采用雙因素方差分析，然后采用Tukey’s多重對(duì)比法進(jìn)行兩兩對(duì)比。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) "果

2.1 兩組小鼠空間型學(xué)習(xí)能力比較

雙因素方差分析顯示，訓(xùn)練天數(shù)和藥物處理兩種因素對(duì)小鼠的逃避潛伏期不存在交互作用（F=0.127，Pgt;0.05）。藥物處理對(duì)小鼠逃避潛伏期不存在作用，兩組各時(shí)間逃避潛伏期比較差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。訓(xùn)練天數(shù)對(duì)小鼠空間型學(xué)習(xí)能力有影響（F=11.940，Plt;0.01），兩組小鼠第7天逃避潛伏期均較第1天縮短，差異有顯著性（Plt;0.01）。表明小鼠的空間型學(xué)習(xí)不受PLX5622投食的影響。見表1。

2.2 兩組小鼠空間型記憶能力對(duì)比

雙因素方差分析顯示，藥物處理和迷宮象限兩種因素對(duì)小鼠的探索時(shí)長(zhǎng)百分比有交互作用（F=8.473，Plt;0.01）。藥物處理對(duì)小鼠探索時(shí)長(zhǎng)百分比不存在作用，兩組各象限探索時(shí)長(zhǎng)百分比差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。迷宮象限對(duì)小鼠探索時(shí)長(zhǎng)百分比有影響（F=111.400，Plt;0.01），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠在圓臺(tái)象限的探索時(shí)長(zhǎng)百分比均顯著高于其他3個(gè)象限，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），說(shuō)明經(jīng)過(guò)6 d練習(xí)兩組小鼠均獲得了空間型記憶。兩組圓臺(tái)象限探索時(shí)長(zhǎng)百分比比較，差異有顯著性（t=3.556，Plt;0.01）;兩組穿越圓臺(tái)的次數(shù)及游泳速度比較，差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。見表2、3。

2.3 兩組小鼠ROI小膠質(zhì)細(xì)胞比較

小鼠ROI小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1免疫染色陽(yáng)性（綠色熒光），成熟神經(jīng)元呈NeuN免疫染色陽(yáng)性（紅色熒光）。熒光定量分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠ROI每平方毫米小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目明顯少于對(duì)照組（t=11.430，Plt;0.01）;而兩組小鼠ROI成熟神經(jīng)元數(shù)量差異無(wú)顯著性（Pgt;0.05）。見表4。

3 討 "論

小膠質(zhì)細(xì)胞不僅是大腦的免疫型細(xì)胞，同時(shí)在大腦的發(fā)育、神經(jīng)元的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)，以及中樞類神經(jīng)受損與修復(fù)等生理過(guò)程中都起著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦中存在的巨噬細(xì)胞，但是由于其獨(dú)特的表型和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中微環(huán)境的嚴(yán)格調(diào)節(jié)，小膠質(zhì)細(xì)胞主要負(fù)責(zé)消除可能危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微生物、壞死細(xì)胞、多余的突觸、蛋白質(zhì)的聚集體以及其他顆粒和可溶性的抗原等[20-21]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要來(lái)源，是中樞性神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵遞質(zhì)，可以誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)廣泛的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞的功能變化與老化以及神經(jīng)變性相關(guān)度很高[5，22-23]。

有研究顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞的存活離不開CSF1R信號(hào);而PLX5622是最新研制成功的特異度很高的CSF1R抑制劑，其特點(diǎn)是可口服，可透過(guò)血-腦脊液屏障，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的清除率高，連續(xù)給小鼠喂食2周PLX5622可以清除腦中90%以上的小膠質(zhì)細(xì)胞[24]。同時(shí)，PLX5622還具有不影響小鼠基本生理活動(dòng)和行為的特點(diǎn)[11，25]。

本研究通過(guò)投食PLX5622消除腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，采取Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞消除對(duì)小鼠空間型學(xué)習(xí)與記憶的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與相關(guān)研究結(jié)果相一致[12，15]。本文研究結(jié)果顯示，海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞清除對(duì)小鼠的空間型記憶力有一定的抑制作用，表現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)組在圓臺(tái)所在象限的探索時(shí)長(zhǎng)的百分比顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明生理狀況下海馬內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞參與空間型記憶的調(diào)節(jié)。本文結(jié)果還顯示，兩組小鼠定位航行的圓臺(tái)逃避的潛伏期和運(yùn)動(dòng)速度差異無(wú)顯著性，兩組小鼠空間探索時(shí)在圓臺(tái)所在象限逗留的時(shí)長(zhǎng)均較其他象限明顯延長(zhǎng)，表明PLX5622誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞清除并不影響小鼠的空間探索、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、空間型學(xué)習(xí)與記憶獲取。本文結(jié)果可為后續(xù)開展小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)阿爾茨海默癥等神經(jīng)退變性疾病的影響及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，生理狀態(tài)下海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)小鼠的空間型記憶有重要的調(diào)節(jié)作用。其分子和細(xì)胞機(jī)制需要深入的研究。衰老、神經(jīng)變性和慢性應(yīng)激都可能導(dǎo)致認(rèn)知與情感障礙，同時(shí)伴隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活和促炎性改變。小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活導(dǎo)致記憶受損已有不少報(bào)道[20，26-31]。因此，清除異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可能為認(rèn)知障礙的治療或干預(yù)提供新的思路和靶點(diǎn)。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）