[摘要] 目的 探究檸檬酸鐵胺（FAC）對SH-SY5Y多巴胺能細胞系葡萄糖腦苷脂酶（GCase）活性及其蛋白表達的影響。方法 用FAC、GCase活性抑制劑環(huán)己烯四醇環(huán)氧化物（CBE）分別或共同處理細胞48 h，應用熒光法檢測GCase活性，免疫印跡法檢測GCase蛋白表達。結果 FAC和CBE兩種因素共處理，對GCase活性及其蛋白表達的影響不存在交互作用（P>0.05）。FAC處理SH-SY5Y細胞后，GCase活性降低，蛋白表達升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=8.191、4.934，P<0.05）;CBE處理SH-SY5Y細胞后，GCase活性降低，蛋白表達升高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=14.605、4.182，P<0.05）。結論 高鐵可降低SH-SY5Y細胞中GCase的活性，升高蛋白的表達。

[關鍵詞] 鐵;檸檬酸鹽類;葡糖苷酰鞘氨醇酶;SH-SY5Y細胞

[中圖分類號] R338.1;R345.62 "[文獻標志碼] A "[文章編號] 2096-5532（2020）02-0143-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.058 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200407.0930.004.html;2020-04-07 14：57

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on glucocerebrosidase （GCase） activity and expression in SH-SY5Y dopaminergic cells. "Methods SH-SY5Y dopaminergic cells were treated with FAC and the GCase inhibitor conduritol B epoxide （CBE）， alone or in combination， for 48 h. Fluorometric assay was used to determine the GCase acti-vity. Western blotting was performed to determine the expression level of GCase. "Results When FAC and CBE were used in combination to treat the SH-SY5Y cells， there was no interaction between them with regard to the effect on GCase activity and expression （Pgt;0.05）. SH-SY5Y cells treated with FAC alone showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=8.191，4.934，Plt;0.05）; SH-SY5Y cells treated with CBE alone also showed a significantly decreased GCase activity and a significantly increased GCase expression level compared with the control group （F=14.605，4.182，Plt;0.05）. "Conclusion High level of iron can decrease the activity and increase the expression level of GCase in SH-SY5Y cells.

[KEY WORDS] iron; citrates; glucosylceramidase; SH-SY5Y cells

近年來遺傳基因的發(fā)現(xiàn)為家族性和散發(fā)性帕金森?。≒D）的發(fā)病機制提供新見解，有5%～10%的PD病例是遺傳因素所致[1-2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PD病人中編碼葡萄糖腦苷酯酶（GCase）的基因GBA突變率達20%，因此GBA突變是目前已知的PD和相關突觸核蛋白病發(fā)展的最常見的遺傳危險因素[3-5]。GCase是一種具有497個氨基酸的膜相關性蛋白，該蛋白在內質網中合成和經糖基化修飾后，被溶酶體膜整合蛋白-2轉運至溶酶體中，發(fā)揮生物學功能[6]。GCase活性的降低可以導致葡萄糖神經酰胺的聚積，進而導致戈謝病的發(fā)生[7]。在PD中，GBA突變降低了GCase的活性，導致α-突觸核蛋白聚集，而聚集的α-突觸核蛋白又進一步促進了GCase活性的降低，形成惡性循環(huán)，造成多巴胺能神經元的死亡，因此GCase的活性與PD的發(fā)病進程密切相關[8-12]。鐵是PD發(fā)病的重要因素之一[13]，鐵可以誘導氧化應激和鐵死亡等[14-16]，從而造成多巴胺能神經元的選擇性損傷。然而，目前關于鐵對GCase活性及其蛋白表達的影響尚未見報道。因此，本研究應用檸檬酸鐵銨（FAC）制備SH-SY5Y多巴胺能細胞系的高鐵模型，并使用GCase的不可逆競爭性抑制劑環(huán)己烯四醇環(huán)氧化物（CBE）作為對照藥，探討鐵對GCase活性及其蛋白表達的影響?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SH-SY5Y細胞系由中國科學院上海細胞庫提供，DMEM高糖基礎培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自以色列BI公司，4-甲基傘形酮-β-葡萄糖苷（4-MU-β-GLC）、CBE、FAC和GCase一抗購自美國Sigma公司，β-actin抗體、HRP-IgG標記的二抗購自北京博奧森公司，ECL發(fā)光液為Millipore公司產品，其他試劑均為國產分析純。

1.2 SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)

實驗前將實驗器具高壓滅菌。從液氮中取出凍存的SH-SY5Y細胞轉移到37 ℃水浴中迅速（30 s內）解凍，充分搖勻后置于離心機中，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)液吹打均勻后接種到25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，光鏡下觀察細胞是否貼壁，然后置于培養(yǎng)箱中（37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2）培養(yǎng)，每隔2 d傳代1次。

1.3 實驗分組及處理

將SH-SY5Y細胞分為對照組（A組）、FAC處理組（B組）、CBE處理組（C組）、FAC和CBE共處理組（D組）。將SH-SY5Y細胞以2×104/cm2的密度接種于6孔板中，每孔加入1.5 mL的細胞混懸液。當細胞達到50%～70%融合時，對照組加入新鮮無血清的培養(yǎng)液;FAC處理組加入100 μmol/L的FAC;CBE處理組則加入100 μmol/L的CBE;FAC和CBE共處理組先加入100 μmol/L的CBE預孵育30 min，再加入100 μmol/L的FAC。上述各組藥物處理時間均為48 h。

1.4 GCase酶活性的測定

藥物處理48 h后每孔加入100 μL的磷酸鹽緩沖液，于冰上靜置30 min后用刮板刮下細胞并在細胞破碎儀中破碎，破碎強度為30%;在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min;取2.5 μL的上清，加入5 mmol/L的4-MU-β-GLC 12.5 μL，37 ℃孵育30 min后，加入1 mol/L的甘氨酸緩沖液（pH值=10）終止反應。在酶標儀上設定激發(fā)光波長EX=360 nm、發(fā)射光波長Em=460 nm，檢測產物4-甲基傘形酮的含量，以相對熒光單位（RFU）表示，并應用BCA蛋白定量試劑盒檢測提取樣品的蛋白濃度（RFU/μg總蛋白）。

1.5 免疫印跡法檢測GCase蛋白表達

藥物處理48 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白的濃度，以每孔總蛋白量為20 μg計算蛋白上樣量，加入Loading Buffer，95 ℃煮5 min。經120 g/L的SDS-PAGE凝膠電泳后濕轉到0.45 μm 的PVDF膜上，室溫下用100 g/L的脫脂奶粉溶液封閉2 h，再分別加入GCase（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗于4 ℃搖床過夜。第2天用山羊抗兔的HRP-IgG（1∶10 000）孵育1 h后以TBST溶液洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光液顯影后用Image J統(tǒng)計結果。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果以±s表示，針對FAC和CBE兩種處理因素，采用析因設計的方差分析進行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 "果

2.1 FAC對GCase活性的影響

析因設計方差分析顯示，F(xiàn)AC和CBE這兩種因素對GCase活性的影響不存在交互作用（P>0.05），因此進一步分析FAC、CBE主效應的結果是否具有統(tǒng)計學意義。100 μmol/L FAC處理SH-SY5Y細胞48 h后，F(xiàn)AC處理組酶活性較對照組有明顯的下降，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.191，P<0.05）;在CBE處理SH-SY5Y細胞48 h后，CBE處理組酶活性也較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（F=14.605，P<0.05）。見表1。

2.2 FAC對GCase蛋白表達的影響

析因設計方差分析顯示，F(xiàn)AC和CBE兩種因素不存在交互作用（P>0.05），因此進一步分析FAC、CBE主效應是否有統(tǒng)計學意義。100 μmol/L FAC處理SH-SY5Y細胞48 h后，F(xiàn)AC處理組蛋白表達較對照組明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.934，P<0.05）;在100 μmol/L CBE處理SH-SY5Y細胞48 h后，CBE處理組與對照組比較蛋白表達明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.182，P<0.05）。見表1。

3 討 "論

PD的發(fā)病機制迄今未明，研究表明遺傳因素、環(huán)境因素和老化因素均可參與PD中多巴胺能神經元的變性死亡過程[17-19]。據(jù)文獻報道，在PD病人的黑質（SN）中鐵的總量隨疾病嚴重程度的增加而增加[20-23]，這些過量的不穩(wěn)定性鐵可通過Fenton反應催化產生具有高細胞毒性的羥自由基[14，22-25]，導致細胞死亡，從而造成疾病的發(fā)生。在GBA突變的PD病人的小腦、殼核、杏仁核、SN中GCase活性降低，其中以SN最明顯。同時，在非GBA突變的散發(fā)性PD病人小腦和SN中GCase活性也明顯下降[26-27]。在6-羥基多巴胺制備的PD大鼠模型中，檢測到SN和紋狀體的GCase活性下降[28]。

本實驗用100 μmol/L FAC、100 μmol/L CBE處理SH-SY5Y多巴胺能神經元細胞系，研究鐵對GCase活性及蛋白表達的影響。文獻報道，溶酶體內的酶都是水解酶，而且一般最適pH值為5.0，所以都是酸性水解酶[29]。有研究表明，在鐵負載的細胞中，溶酶體pH值從5.0增加到5.7，高鐵破壞了細胞內溶酶體的酸性環(huán)境[30]。本研究結果顯示，在FAC處理SH-SY5Y細胞48 h后，GCase的活性明顯降低，提示細胞內的高鐵環(huán)境破壞了溶酶體內的酸性環(huán)境，從而使GCase的活性降低。而GCase活性的降低可能代償性地引起了GCase蛋白表達的增加。有關文獻報道，神經元中加入野生型或者A53T突變的α-突觸核蛋白在降低溶酶體中GCase活性的同時增加了GCase的蛋白表達，α-突觸核蛋白可抑制GCase在細胞內的運輸[31]。既往有研究表明，在SH-SY5Y細胞中，F(xiàn)AC可以誘導α-突觸核蛋白表達升高[32-33]，CBE也可以誘導α-突觸核蛋白表達升高[34-36]。本實驗加入鐵后細胞的GCase蛋白表達明顯升高，推測可能是細胞內高鐵環(huán)境誘導了α-突觸核蛋白表達升高，升高的α-突觸核蛋白抑制了內質網中GCase的合成，使其不能折疊成正常的構象而無法到達高爾基體加工成熟，未加工成熟的蛋白不具備酶的活性，因此GCase蛋白的表達升高，而酶活性降低。本實驗中沒有觀察到FAC與GCase抑制劑兩者的協(xié)同作用（析因設計方差分析顯示，F(xiàn)AC、CBE兩種因素之間無交互作用，因此說明FAC與CBE無協(xié)同作用）。

綜上所述，在高鐵環(huán)境下，SH-SY5Y細胞內GCase的活性降低，蛋白的表達升高。本實驗結果為進一步深入研究GCase在PD發(fā)病中的作用提供了一定的實驗依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）