盧軍霞 董炳梅

（1，河北石家莊工程職業(yè)學(xué)院 050000；2，山東綠都生物科技有限公司 256600）

水貂病毒性腸炎是由水貂細(xì)小病毒引起的一種以劇烈腹瀉為主要特征的急性、烈性、高度接觸性傳染病，是危害水貂養(yǎng)殖業(yè)的 3 大疫病之一[1,2]。本病多發(fā)生于 7～9 月份，傳染源多為患病/帶毒水貂，其傳播途徑主要為經(jīng)口與呼吸道傳播[3]。患病貂場(chǎng)如不及時(shí)采取有效措施加以控制，該病常會(huì)引起地方性、周期性流行，且第二年仔貂斷乳前后有再次發(fā)生的可能。該病毒對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，在污染的籠舍可存活5～10 個(gè)月[4]；冷凍狀態(tài)下，其毒力可維持一年不下降；56℃30min 可使該病毒滅活；但水貂細(xì)小病毒對(duì)福爾馬林與苛性鈉比較敏感，0.5%福爾馬林或2%苛性鈉溶液，室溫12h 可使該病毒失去活力，這也是該病難以根除的原因之一。近年來(lái)，隨著毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖規(guī)模與養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，因免疫程序不合理及飼養(yǎng)條件差等原因，該病在我國(guó)水貂養(yǎng)殖區(qū)仍時(shí)有發(fā)生[5]。

山東某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)水貂約2000 只，近期陸續(xù)出現(xiàn)體溫升高、厭食、嘔吐、腹瀉等癥狀，糞便呈淺黃色與煤焦油樣，且斷奶仔貂發(fā)病率高于成年水貂。該貂場(chǎng)發(fā)病率為52.3%，死亡率為65.8%。剖檢可見(jiàn)心外膜出血，胃黏膜有點(diǎn)狀出血，小腸腸壁變薄，腸黏膜出血，腸內(nèi)容物含有黏稠的纖維素性物質(zhì)多呈暗紅色，腸系膜淋巴結(jié)腫大充血。綜合以上癥狀及剖檢變化，結(jié)合該貂場(chǎng)免疫情況，初步判斷為水貂細(xì)小病毒感染。通過(guò)一系列的防控措施使該病得以有效控制，從而為本地區(qū)該類(lèi)疾病的診療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

貓腎傳代細(xì)胞系F81，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 鑒別用血清

1.1.3 試劑

DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自 GIBCO 公司。PCR 10×buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs 購(gòu)自寶生物 （大連） 生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 水貂腸炎病毒的分離

取山東省某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的疑似水貂細(xì)小病毒感染的水貂糞便，加適量的生理鹽水，-20℃反復(fù)凍融 3 次，10000r 離心 20min，取上清液，經(jīng) 0.22μm 微孔的濾膜過(guò)濾，加入青、鏈霉素至100U/ml，置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 檢測(cè)

取處理好的病料，應(yīng)用酚氯仿抽提法提取總DNA 作為模板，應(yīng)用 PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 25μl，其中含有 10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，MgCl2 2.5μl，Taq 酶 1μl，引物1 和 2 各 1μl，DNA 模板 0.5μl，去離子水 16.5μl。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，冷至4℃保存。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，所擴(kuò)增目的片段為600bp。上、下游引物分別為：

MEV-1：5’ -GTAAGCTTCCAGGAGACTTT-3’

MEV-2：5’ -GTAAGCTTCGTCGTGTTCTT-3’

1.2.3 病毒分離

將F81 細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將上述處理的濾液，同步接種于F81 細(xì)胞中[6]，接毒量為細(xì)胞培養(yǎng)液的1/10，置于37℃培養(yǎng)箱中，觀察5～7d，并盲傳三代，同時(shí)設(shè)1 瓶正常細(xì)胞對(duì)照。

1.2.4 水貂腸炎病毒的鑒定及生物學(xué)特性的測(cè)定

1.2.4.1 PCR 鑒定

將細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3 次后，10000r 離心20min，取上清，按照1.2.2 的方法進(jìn)行PCR 鑒定。

1.2.4.2 紅細(xì)胞凝集譜的測(cè)定

應(yīng)用微量凝集試驗(yàn)，將雞、豬、綿羊、豚鼠、小白鼠、兔子與人O 型紅細(xì)胞0.015 M pH6.5 的PBS 緩沖液稀釋成1%的紅細(xì)胞懸液，按常規(guī)方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的血凝特性，以50%以上紅細(xì)胞凝集判定為紅細(xì)胞凝集陽(yáng)性。

1.2.4.3 對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)

將細(xì)胞培養(yǎng)物與水貂細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照病毒加入氯仿抽提10min，3000r 離心 10min，取上清液備用。用 pH8.6 0.025mol/L的巴比妥緩沖液配制1%的瓊脂凝膠，冷凝后打孔，在相對(duì)的2孔內(nèi)分別加入抗原與血清。加樣后，置于電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳。在抗原孔和血清孔之間出現(xiàn)白色沉淀線(xiàn)判為陽(yáng)性，不產(chǎn)生沉淀線(xiàn)者判為陰性。

1.2.4.4 細(xì)胞培養(yǎng)物毒力的測(cè)定

（1） HA 效價(jià)的測(cè)定

將細(xì)胞培養(yǎng)物用0.015M pH6.5 的 PBS 緩沖液進(jìn)行2x 倍比稀釋后，加入1%豬紅細(xì)胞，4℃作用 60min，觀察紅細(xì)胞凝集情況，計(jì)算HA 效價(jià)。

（2） TCID50 的測(cè)定

將F81 細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。隨后應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行10x 倍比稀釋?zhuān)捎猛浇佣痉ǎ尤牒?F81 細(xì)胞的 96 孔板中，100μl/孔，置于 37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察并記錄細(xì)胞病變情況，應(yīng)用Reed-Muench 法計(jì)算分離病毒的TCID50。

1.2.5 動(dòng)物感染試驗(yàn)

選取血清 HA 效價(jià)≤1：4 的健康易感水貂 6 只，其中 4 只灌服 15ml 細(xì)胞培養(yǎng)物，另 2 只作為對(duì)照，灌服 15ml 正常 F81 細(xì)胞培養(yǎng)液，隔離觀察，并于每天觀察記錄臨床癥狀、收集糞便，10d 后對(duì)所有水貂進(jìn)行剖殺，觀察腸道等臟器的病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 檢測(cè)結(jié)果

將處理好的病料提取基因組作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出一條600bp 左右的片段，初步判定該場(chǎng)水貂攜帶有水貂細(xì)小病毒 （圖1）。

2.2 病毒的分離與鑒定

2.2.1 疑似水貂細(xì)小病毒的分離

將處理好的病料按同步接毒的方法接種F81 細(xì)胞后，觀察5～7d，并盲傳 3 代。傳代至 F3代，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞病變，局部細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)，隨后逐漸擴(kuò)展，直至細(xì)胞溶解脫落 （圖2）。

2.2.2 水貂細(xì)小病毒的鑒定

取疑似水貂細(xì)小病毒感染病料的細(xì)胞培養(yǎng)物F3 代，常規(guī)方法提取模板DNA，經(jīng)PCR 檢測(cè)，證明該細(xì)胞培養(yǎng)物為水貂細(xì)小病毒陽(yáng)性。紅細(xì)胞凝集譜測(cè)定結(jié)果顯示，該細(xì)胞毒只可凝集豬紅細(xì)胞，其余紅細(xì)胞均不發(fā)生凝集反應(yīng)。應(yīng)用對(duì)流免疫電泳測(cè)定結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)物、水貂細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照與水貂細(xì)小病毒陽(yáng)性血清均出現(xiàn)沉淀線(xiàn)，進(jìn)一步證明細(xì)胞培養(yǎng)物為水貂細(xì)小病毒。

2.3 分離病毒毒力的測(cè)定

盲傳三代后，TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞毒TCID50為10-5.68/0.1ml；HA 效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示，該分離病毒的血凝價(jià)為 1：256。

2.4 水貂感染性試驗(yàn)

將細(xì)胞培養(yǎng)物接種健康易感水貂4 只，隔離觀察，接種后4d，水貂出現(xiàn)減食、排稀便現(xiàn)象；接種后 5～7d，4 只水貂均出現(xiàn)厭食甚至廢食、體溫升高、脫水、套管樣糞便與血便；對(duì)照組正常，無(wú)任何不良癥狀。將4 只發(fā)病水貂進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)尸體消瘦、腸道黏膜變薄、充血、出血，腸道內(nèi)混有紅色血狀物。

3 討論

水貂細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。其中肉食獸細(xì)小病毒主要包括貂細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒、貉細(xì)小病毒和藍(lán)狐細(xì)小病毒等[7,8]。細(xì)小病毒在自然界分布極為廣泛，且對(duì)外界因素具有強(qiáng)大的抵抗力[9]。水貂細(xì)小病毒在加拿大安大略省威廉堡地區(qū)1947 年首次發(fā)生，而該病在我國(guó)于1974 年才首次報(bào)道，此后逐漸蔓延至全國(guó)，給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。目前，在我國(guó)水貂細(xì)小病毒的預(yù)防主要是免疫接種，但近年來(lái)疫苗免疫失敗的現(xiàn)象屢有發(fā)生。在本研究中，由于該養(yǎng)殖場(chǎng)一段時(shí)間內(nèi)應(yīng)用毛蛋等不良飼料原料，導(dǎo)致水貂抵抗力降低，且輕度腹瀉，也因此錯(cuò)過(guò)了水貂細(xì)小病毒的最佳免疫時(shí)間，最終導(dǎo)致該病的發(fā)生。

水貂細(xì)小病毒病的特點(diǎn)為病程短、病情極易惡化。目前，水貂細(xì)小病毒尚無(wú)有效的藥物與治療方法，其治療原則主要是切斷傳播途徑，中和病毒，對(duì)癥治療，防止繼發(fā)感染[11]。在該養(yǎng)殖場(chǎng)，首先停用不良飼料原料，并對(duì)籠舍、場(chǎng)地等進(jìn)行嚴(yán)格的消毒工作，對(duì)死亡的水貂采取無(wú)害化處理；其次隔離病貂，并肌肉注射高免血清與抗生素，同時(shí)全場(chǎng)應(yīng)用葡萄糖及多種維生素飲水；最后應(yīng)用水貂腸炎滅活疫苗進(jìn)行緊急接種，小于3月齡的仔貂 3 頭份/只，3 月齡以上的貂 5 頭份/只。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的處理，該病得到良好的控制。