楊顯超 李凱航 陶田谷晟 趙洪進(jìn) 楊德全 吳秀娟 盧軍 王建

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心 201103）

眾所周知，牛結(jié)核病是一種慢性人畜共患病，傳染范圍廣和傳染力強(qiáng)，該病嚴(yán)重?fù)p害整個畜牧業(yè)，威脅到人類健康[1]。該傳染疾病非常重要的一個途徑就是通過乳制品感染人。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) （ELISPOT） 是一種細(xì)胞免疫學(xué)檢測方法，在單細(xì)胞水平上基于高通量檢測機(jī)體分泌的抗體或細(xì)胞因子，從而得出我們所需，它其實(shí)就是ELISA 檢測技術(shù)的外延[2]。因?yàn)镋LISPOT 敏感性和特異性高，已被廣泛用于各種傳染病的檢測。本研究旨在通過細(xì)胞免疫學(xué)手段，通過課題前期建立的牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT 檢測平臺，為日后基于此類方法進(jìn)行牛結(jié)核病的檢測和采取相應(yīng)的防控措施，奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

上海某區(qū)5 個奶牛場共有1687 頭奶牛，每年兩次檢疫使用頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) （SICT），出現(xiàn)陽性或可疑牛再對其及周圍接觸較為密切的牛只進(jìn)行γ 干擾素ELISPOT 檢測，目的在于更好的凈化牛結(jié)核病。

1.2 主要試劑、設(shè)備

牛結(jié)核菌素購自某生物科技有限公司，試劑批號201008；牛γ-干擾素ELISPOT 檢測試劑盒購自上海欣博盛生物科技有限公司，批號 3119-4HPW-2。酶標(biāo)讀數(shù)儀 Tecan Sunrise；酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像自動分析儀 （CTL ImmunoSpot S6）。

1.3 牛結(jié)核變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)

奶牛結(jié)核病按照國家標(biāo)準(zhǔn) （GB/T18645-2002），用牛型結(jié)核分枝桿菌PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行奶牛結(jié)核病檢測。判定標(biāo)準(zhǔn)為局部炎性反應(yīng)明顯，皮厚差≥4mm 判定為陽性牛；局部炎性反應(yīng)不明顯，2mm≤皮厚差＜4mm 判定為可疑牛；無炎性反應(yīng)，皮厚差＜2mm 判定為陰性牛[3]。

1.4 ELISPOT 方法檢測

1.4.1 牛外周血單核細(xì)胞的制備

奶牛尾靜脈無菌抽取至少3ml 肝素抗凝血，吸取2ml 血與滅菌生理鹽水 1：1 混合后，緩緩地加入含3ml 牛淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，400g 離心20min。這時，外周血單核細(xì)胞聚集在云霧狀層中，吸取單核細(xì)胞層加入滅菌PBS 混勻后，200g 離心10min，重復(fù)以上步驟兩次。棄去上清，加入1640 培養(yǎng)基重懸，用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)。

1.4.2 牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT 檢測

按試劑盒說明書進(jìn)行操作。大致步驟為在96 孔濾膜板中每孔加入 100μl 2.5μg/ml 的牛 γ 干擾素抗體 MT17.1，4℃包被過夜。在包被的板中，一份樣品分 3 管加入 50μl 培養(yǎng)液、10μg/ml 的 禽 型 PPD、10μg/ml 的 牛 型 PPD。然 后 加 入50μl1.25×105細(xì)胞數(shù)的外周血單個核細(xì)胞懸液，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h；取出棄培養(yǎng)上清，洗板 5 次，加入100μl牛 γ-干擾素檢測抗體 MT307-biotin （0.25μg/ml），室溫孵育2h；洗板 5 次，加入 100μl HRP，37℃孵育 1h；加入 100μl 底物，室溫避光顯色。加入純凈水終止反應(yīng)，移除液體晾干；將96 孔板放入CTL ImmunoSpot S6 中，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行掃描計數(shù)和分析[4]。

1.5 ELISPOT 同步檢測牛結(jié)核病臨床樣品

用1.3 方法檢測上海某區(qū)5 個奶牛場的1687 頭奶牛，選取陽性、可疑牛及其周邊密切接觸的牛群228 頭，采集其全血樣品進(jìn)行ELISPOT 檢測，具體參照1.4 和1.5 步驟進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 變態(tài)反應(yīng)檢測結(jié)果

一共對5 個奶牛場1687 頭奶牛進(jìn)行頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（SICT），根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，共檢出牛結(jié)核病陽性牛13頭，陽性率為0.77%，陽性牛未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀；檢出結(jié)核病可疑牛36 頭，其余皆為陰性。

2.2 牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT 檢測結(jié)果

頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) （SICT） 全檢 1687 頭奶牛后，將陽性牛、可疑牛及其密切接觸牛228 頭牛進(jìn)行γ 干擾素ELISPOT 檢測，出現(xiàn)15 例牛結(jié)核分枝桿菌陽性、213 例陰性。

2.3 兩種方法符合率的比較

對上海存欄為1687 頭奶牛進(jìn)行頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（SICT），參見附表。共有 13 頭陽性奶牛，36 頭可疑牛檢出，其余均為陰性，陽性牛未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。抽取228 頭陽性牛、可疑牛及其密切接觸牛228 頭牛抗凝血進(jìn)行牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT 檢測，結(jié)果牛型結(jié)核病陽性15 份，陰性213 份。說明牛結(jié)核PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)結(jié)合γ 干擾素ELISPOT 可以有效提高牛結(jié)核病檢疫的準(zhǔn)確性，減少因單純使用頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) （SICT） 出現(xiàn)的假陰性現(xiàn)象。在變態(tài)反應(yīng)可疑牛中，仍然檢出了2 份γ-干擾素ELISPOT 陽性牛，兩者陽性符合率93%，陰性符合率99%。

附表 ELISPOT 方法與PPD 的比較 (單位：頭)

3 討論

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測技術(shù) （ELISPOT） 是近些年發(fā)展起來的新技術(shù)，是一種基于檢測細(xì)胞因子的免疫學(xué)方法。該方法是將細(xì)胞培養(yǎng)與ELISA 技術(shù)結(jié)合起來新構(gòu)建的一種檢測技術(shù)，是在單細(xì)胞培養(yǎng)水平上體外檢測特異性細(xì)胞因子。可以對細(xì)胞因子分泌量進(jìn)行方便快速的定量檢測，目前已經(jīng)是國際上一項(xiàng)主流的免疫學(xué)檢測技術(shù)。并且ELISPOT 檢測技術(shù)也在動物研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[5]。

γ-干擾素ELISPOT 在結(jié)核病診斷上有很大意義，但在某些方面仍有一定的局限性。一是ELISPOT 檢測技術(shù)能檢測牛結(jié)核分枝桿菌，但其結(jié)果不能作為標(biāo)準(zhǔn)來直接判定是否為活動性結(jié)核病，且敏感性不是很高，因此在牛結(jié)核流行污染地區(qū)不能單獨(dú)用此方法來排除結(jié)核病的類型[6]。二是環(huán)境中的結(jié)核分枝桿菌能明顯影響ELISPOT 的結(jié)果，環(huán)境的暴露強(qiáng)度與該病的檢測有正相關(guān)性[7]。因此，運(yùn)用該檢測方法作為單一判斷標(biāo)準(zhǔn)可能會對結(jié)果造成誤診，故需要針對不同地區(qū)和不同牛群調(diào)整監(jiān)測策略。三是此方法需要分離機(jī)體的外周血淋巴細(xì)胞，這對實(shí)驗(yàn)人員的操作水平提出要求。最后，由于ELISPOT 檢測的費(fèi)用高，使其較難進(jìn)行大范圍的推廣和應(yīng)用。免疫學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，ELISPOT 在動物疫病診斷的領(lǐng)域的應(yīng)用也會更加深入，我們相信該技術(shù)會逐漸成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的候選檢測技術(shù)。