王之瑩，于文杰，謝瑞彬，喬 璐，陳愛(ài)亮

利用側(cè)流核酸試紙條快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒

王之瑩，于文杰，謝瑞彬，喬 璐，陳愛(ài)亮※

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081）

為滿足基層普通實(shí)驗(yàn)室或養(yǎng)殖場(chǎng)等資源有限的實(shí)驗(yàn)室對(duì)非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）的檢測(cè)需求，該研究開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速、低成本的檢測(cè)技術(shù)，可以用肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。研究將傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）與膠體金試紙條技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)一種低成本的側(cè)流核酸測(cè)定試紙條（lateral flow nucleic acid assay, LFNAA）。該體系設(shè)計(jì)了獨(dú)特的尾引物，避免了傳統(tǒng)核酸試紙條的半抗原標(biāo)記及抗體的使用。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生一端帶著單鏈寡核苷酸尾巴的雙鏈DNA產(chǎn)物，能夠與膠體金標(biāo)記的寡核苷酸捕獲探針結(jié)合，從而在試紙條上形成可以用肉眼觀察的目標(biāo)產(chǎn)物。該LFNAA試紙條能夠在豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CFSV）、豬瘟病毒豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus 1, PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus virus, PPV）中特異的鑒定出ASFV的存在，其靈敏度與瓊脂糖凝膠電泳的分析結(jié)果一致，均能達(dá)到103copies/L。因此，僅需要一臺(tái)普通PCR儀，即可對(duì)ASFV進(jìn)行快速靈敏的鑒定（<2 h），其低成本、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)非常適合資源有限的實(shí)驗(yàn)室中非專(zhuān)業(yè)人員的操作。此外，該技術(shù)可進(jìn)一步結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能夠在食品安全和醫(yī)學(xué)診斷中實(shí)現(xiàn)更快更簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

動(dòng)物；養(yǎng)殖；非洲豬瘟（ASFV）；傳統(tǒng)PCR技術(shù)；側(cè)流核酸測(cè)定（LFNAA）；尾引物；低成本

0 引 言

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的接觸性傳染病，是最嚴(yán)重的動(dòng)物疾病之一，其感染期間的臨床癥狀與豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）所見(jiàn)無(wú)異，且能夠?qū)е赂甙l(fā)病率和高死亡率[1]。該病首次發(fā)現(xiàn)于肯尼亞，近年來(lái)已經(jīng)傳播到歐洲、非洲、美洲等地區(qū)[2]。在中國(guó)，2018年8月爆發(fā)首例ASFV疫情，截至2019年7月，已經(jīng)確診了149例疫情，捕殺了超過(guò)100萬(wàn)頭豬[3]。ASFV這種毀滅性疾病能夠造成受感染動(dòng)物的死亡率高達(dá)100%，嚴(yán)重影響了全球養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，使得2019年豬肉價(jià)格上漲了約20%，與2018年同期相比增加30%[4]，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著食品安全，如“三全食品的灌湯水餃中疑似檢出非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性”事件的發(fā)生。然而, 目前尚無(wú)有效的疫苗或者控制方法來(lái)預(yù)防該疾病的傳播，捕殺措施是唯一的防控手段[5]。因此，快速、簡(jiǎn)便、可靠的ASFV鑒別方法對(duì)于疫情控制的具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International des Epizooties, OIE）推薦的ASFV診斷技術(shù)[6]如紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（hemadsorption test, HAD）、免疫吸附試驗(yàn)（immunosorbent assay, ELISA）和熒光抗體試驗(yàn)（fluorescent antibody test, FAT），具有較高的靈敏度，但是這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，限制了其使用推廣[7]。近年來(lái)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）檢測(cè)技術(shù)包括傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR以及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于其高靈敏度和特異性成為應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)手段，同時(shí)也是OIE指定的ASFV檢測(cè)方法之一[8]。熒光定量PCR具有超高靈敏度，但該優(yōu)點(diǎn)反而使得檢測(cè)結(jié)果容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，且對(duì)引物和探針的要求較高，需要價(jià)格昂貴的專(zhuān)業(yè)設(shè)備，因此對(duì)人員的專(zhuān)業(yè)技能要求也相對(duì)較高[9]。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)雖然克服了對(duì)儀器的需求，但其試劑盒的價(jià)格昂貴，而且試劑中的氣溶膠易污染形成假陽(yáng)性結(jié)果[10]。相比較而言，對(duì)于一些地區(qū)特別是發(fā)展中國(guó)家，部分基層實(shí)驗(yàn)室和養(yǎng)殖場(chǎng)的設(shè)備不完善、資源有限，在靈敏度和特異性能夠滿足檢測(cè)需求的基礎(chǔ)上[11]，傳統(tǒng)PCR技術(shù)價(jià)格較低，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，操作方便，更適合于非專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。同時(shí)，隨著便攜式PCR儀[12]的開(kāi)發(fā)，傳統(tǒng)PCR也能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。

然而，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)如凝膠電泳方法，依舊對(duì)時(shí)間和技術(shù)有一定的要求，而作為快速現(xiàn)場(chǎng)分析方法的一種，便攜、低成本、易操作的膠體金試紙條已經(jīng)成為近年來(lái)發(fā)展的熱點(diǎn)[13]，廣泛的應(yīng)用于食品安全和醫(yī)學(xué)檢測(cè)[14]。目前有很多核酸側(cè)流免疫分析法（nucleic acid lateral flow immunoassay, NALFIA）是將正反引物均標(biāo)記半抗原，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生雙半抗原標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠與膠體金（AuNPs）標(biāo)記的捕獲抗體和在檢測(cè)線上固定的報(bào)告抗體進(jìn)行結(jié)合，從而在試紙條上發(fā)生顯色反應(yīng)[15]。然而，抗體的價(jià)格昂貴且難以保存，金標(biāo)抗體偶聯(lián)的過(guò)程也較為復(fù)雜，這些限制了NALFIA在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用[16]。

因此，該研究建立了一種側(cè)流核酸測(cè)定試紙條（lateral flow nucleic acid assay, LFNAA），使用膠體金標(biāo)記的寡核苷酸的捕獲探針能夠直接檢測(cè)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，在PCR正向引物標(biāo)記生物素，反向引物標(biāo)記Spacer C3 和一段寡核苷酸尾巴，形成尾引物，無(wú)需昂貴且難以保存的抗體，且解決了復(fù)雜的膠體金標(biāo)記抗體的需求。在這種獨(dú)特的尾引物的作用下，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生特殊DNA 產(chǎn)物能夠與膠體金標(biāo)記的捕獲探針結(jié)合，在檢測(cè)線上顯示紅色，從而用肉眼觀察目標(biāo)產(chǎn)物的存在。

該研究將傳統(tǒng)PCR技術(shù)與膠體金試紙條技術(shù)相結(jié)合，建立了一種通過(guò)核酸檢測(cè)的LFNAA試紙條，僅需一臺(tái)普通PCR儀，即可實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、靈敏的ASFV鑒別（＜2 h），符合基層普通實(shí)驗(yàn)室或養(yǎng)殖場(chǎng)等資源有限的實(shí)驗(yàn)室中非專(zhuān)業(yè)人員的需求，具有巨大應(yīng)用前景。此外，該技術(shù)也將應(yīng)用于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)更快更簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的技術(shù)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2×Taq Master Mix（購(gòu)自Novoprotein公司）。試紙條的有關(guān)材料，包括背板（J-A6）GL04、硝化纖維素膜（CN140）、吸水墊（H-4）（購(gòu)自Millipore公司）。HAuCl4·4H2O、檸檬酸、TE緩沖液、檸檬酸三鈉和鏈霉親和素（SA）（購(gòu)自Sigma公司）。NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl 均為國(guó)產(chǎn)分析純（國(guó)藥控股化學(xué)試劑有限公司）。熒光定量PCR試劑盒（購(gòu)自Kapa公司）。熒光定量PCR分析采用ABI 7500儀器（購(gòu)自Applied Biosystems公司）。

1.2 試驗(yàn)用基因片段DNA及核酸樣品

參考GenBank中非洲豬瘟病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因p72基因（GenBank：AY578706）[17]，由上海生工生物公司合成基因片段。將獲得的凍干粉用TE緩沖液溶解，并根據(jù)如下公式[18]計(jì)算拷貝數(shù)，最后得到1.75×1010copies/L的ASFV基因片段。

另外，為了確保試驗(yàn)的可用性以及LFNAA的特異性，提取了感染ASFV、感染豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CFSV）、以及健康豬的血液DNA，用紫外分光光度法檢測(cè)提取的DNA的濃度，其濃度均介于10～20 ng/L。同時(shí)，由本實(shí)驗(yàn)室保存的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus 1, PCV1）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2, PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus virus, PPV）的基因片段DNA，進(jìn)行交叉反應(yīng)檢測(cè)。

1.3 試紙條的組裝

如圖1所示，試紙條的檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）分別用試紙條噴膜儀（Biodot XYZ3060）噴涂5 mg/mL的鏈霉親和素（streptavidin, SA）和質(zhì)控探針（提前將1 mg/mL SA與100mol/L生物素化的控制探針在室溫下孵育2 h[19]）。然后，將試紙條在37 ℃下干燥2 h，用切條機(jī)（KM-3100）切成寬度為4 mm的試紙條，密封保存。

圖1 測(cè)流核酸測(cè)定試紙條的原理

1.4 引物的設(shè)計(jì)和修飾

參照PCR引物的設(shè)計(jì)原理，使用Primer 5.0軟件對(duì)ASFV p72基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。然后，按照試紙條的設(shè)計(jì)模式，對(duì)引物進(jìn)行修飾。為了使PCR擴(kuò)增在一個(gè)特殊的無(wú)堿基位點(diǎn)上終止，我們?cè)诜聪蛞锏?′端標(biāo)記Spacer C3，并隨后連接一個(gè)寡核苷酸片段作為尾巴，從而形成尾引物。正向引物標(biāo)記生物素。同時(shí)，為了確保LFNAA的可用性，捕獲探針與寡核苷酸尾巴互補(bǔ)，控制探針與捕獲探針的核苷酸序列互補(bǔ)。引物和探針由上海生工生物公司合成（表1）。

表1 引物和探針的序列

1.5 膠體金AuNPs和金標(biāo)捕獲探針的制備

參考前人對(duì)膠體金試紙條的制備[13,15]，采用檸檬酸三鈉還原法[20]制備13 nm AuNPs。將2.0 mL 194 mmol/L的檸檬酸鈉溶液快速加入到沸騰的100 mL含有0.1% HAuCl4溶液中，當(dāng)溶液的顏色由紫色變?yōu)榧t色時(shí)，表示AuNPs的形成。將溶液冷卻至室溫，儲(chǔ)存于4 ℃。

制備金標(biāo)捕獲探針[21-22]。將20L 100mol/L的捕獲探針緩慢滴加到500L 13 nm的AuNPs中，在黑暗中靜置16 h，然后滴加56L 10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（PB Buffer）（NaH2PO4/Na2HPO4，pH值7.4）和92L 2 M NaCl溶液，再次孵育8 h后，離心30 min（4 ℃，16 100）除去上清液，用0.3 mol/L NaCl（pH 7值）和10 mm PB Buffer洗滌沉淀。最后，將沉淀溶解在含0.3 mol/L NaCl的10 mm PB Buffer中，4 ℃避光保存。

1.6 PCR反應(yīng)和LFNAA的檢測(cè)

使用2×Taq Master Mix在普通PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。每50L反應(yīng)混合物包括Mix 25L，正向引物和反向引物（10M）各2L，DNA模板1L，ddH2O 20L。將反應(yīng)溶液充分混合后，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 90 s；94 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳或LFNAA進(jìn)行分析。

LFNAA檢測(cè)體系：將2L PCR產(chǎn)物添加到90L TE緩沖液中，加入8L金標(biāo)捕獲探針。然后將混合物滴加到試紙條的樣品墊上，并在5 min內(nèi)檢查結(jié)果。

判定方法：1）當(dāng)樣品中含有ASFV DNA時(shí)，金標(biāo)捕獲探針與陽(yáng)性產(chǎn)物和T線的鏈霉親和素形成三明治結(jié)構(gòu)，在T線上顯示肉眼可見(jiàn)的紅色，同時(shí)，過(guò)量的金標(biāo)捕獲探針與C線上固定的控制探針結(jié)合，在C線上顯示紅色。此時(shí)T線與C線均為紅色，當(dāng)T線的顏色等同或深于C線時(shí)，判定為陽(yáng)性結(jié)果；2）當(dāng)樣品中不存在ASFV DNA或者濃度過(guò)低不足以檢出時(shí)，T線不顯色，僅C線顯示紅色，判定為陰性結(jié)果；3）當(dāng)C線不顯色時(shí)，可以判定試紙條失效。

2 結(jié)果與分析

2.1 LFNAA的原理

這項(xiàng)工作開(kāi)發(fā)了一種成本較低的通用型側(cè)流核酸測(cè)定試紙條，將傳統(tǒng)PCR技術(shù)與膠體金試紙條技術(shù)相結(jié)合，基于ASFV 基因組的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，采用獨(dú)特的尾引物和膠體金標(biāo)記的寡核苷酸捕獲探針，能夠直接檢測(cè)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物。如圖1所示，LFNAA試紙條包括固定有5 mg/mL鏈霉親和素的T線以及固定有控制探針的C線。在檢測(cè)過(guò)程中，帶有寡核苷酸尾巴的雙鏈擴(kuò)增子能與金標(biāo)捕獲探針進(jìn)行DNA雜交互補(bǔ)。在陽(yáng)性產(chǎn)物存在的情況下，擴(kuò)增子另一側(cè)標(biāo)記的生物素將與T線上的鏈霉親和素結(jié)合，形成“鏈霉親和素-生物素-擴(kuò)增產(chǎn)物-寡核苷酸尾巴-金標(biāo)捕獲探針”的三明治結(jié)構(gòu)，在T線顯示紅色，表明陽(yáng)性結(jié)果。相反，如果沒(méi)有陽(yáng)性產(chǎn)物，T線就不會(huì)有紅色反應(yīng)。而無(wú)論如何，過(guò)量的金標(biāo)捕獲探針都會(huì)繼續(xù)移動(dòng)，并與C線上的控制探針雜交結(jié)合，顯示紅色，作為L(zhǎng)FNAA的有效對(duì)照。

2.2 PCR引物和LFNAA體系的驗(yàn)證

以ASFV基因片段DNA為陽(yáng)性模板，以ddH2O為空白對(duì)照，驗(yàn)證PCR引物和LFNAA體系的有效性。如圖2a所示，在瓊脂糖凝膠電泳中，ASFV的基因片段DNA模板呈現(xiàn)正確的陽(yáng)性條帶，且無(wú)拖帶現(xiàn)象，而以ddH2O為空白對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有條帶。同樣地，當(dāng)用LFNAA體系檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)（圖2b），陽(yáng)性模板在試紙條上顯示了2條紅線，而空白對(duì)照僅在C線上出現(xiàn)紅色條帶，與以上描述的判定方法相一致。因此，這些結(jié)果表明，該引物可以有效地?cái)U(kuò)增ASFV p72基因，而且這種新型的LFNAA可以應(yīng)用于實(shí)際的檢測(cè)，具有良好的實(shí)用價(jià)值。

1. ASFV的基因片段DNA，2. ddH2O

2.3 LFNAA的檢測(cè)限

將ASFV基因片段DNA按照10倍的梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)渲?.75×105～1.75×102copies/L 的稀釋液用于測(cè)定LFNAA的檢測(cè)限，ddH2O作為空白對(duì)照。以瓊脂糖凝膠電泳為對(duì)照（圖3a），DNA模板在1.75×105～1.75× 103copies/L的濃度范圍內(nèi)（泳道1~3），在電泳中的條帶亮度依次降低，而1.75×102copies/L DNA（泳道4）不能檢測(cè)出電泳條帶。同樣，在圖3 b，LFNAA試紙條在DNA模板1.75×105和1.75×104copies/L時(shí)（試紙條1和2），T線出現(xiàn)明顯的紅色反應(yīng)，DNA模板在1.75× 103copies/L時(shí)（試紙條3），T線出現(xiàn)微弱的紅色條帶，而模板濃度達(dá)到1.75×102copies/L時(shí)（試紙條4），T線無(wú)紅色反應(yīng)，僅在C線顯示紅色。這些結(jié)果說(shuō)明，LFNAA的檢測(cè)限與瓊脂糖凝膠電泳一致，均能檢測(cè)到103copies/L的ASFV DNA模板。此外，查閱湖南國(guó)測(cè)生物科技有限公司開(kāi)發(fā)的熒光定量PCR試劑盒[23]、北京森康生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司開(kāi)發(fā)的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒[24]等中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心認(rèn)可的ASFV檢測(cè)試劑盒的靈敏度，發(fā)現(xiàn)該研究的靈敏度與查閱結(jié)果相一致。

注：1~4分別為1.75×105、1.75×104、1.75×103、1.75×102copies/μL的ASFV基因片段DNA；5為 ddH2O

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

用OIE推薦的熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證實(shí)際樣品，確保模板的準(zhǔn)確性。參考文獻(xiàn)中的引物[25]，上游引物為5′-GGTGTTTGGTTGTCCCAGT-3′，下游引物為5′-TAAAGTACGCCCGCATACG-3′，探針序列為5′-FAM-CTGAATCGGAGCATCCTGCCAG-TAMRA-3′。從圖4a可以看出，只有ASFV的基因片段DNA（曲線1）和從3份感染ASFV的血液樣品中（曲線2～4）提取出的DNA出現(xiàn)擴(kuò)增，而感染CSFV的豬血液DNA（曲線5），PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段（曲線6～10），和健康豬的血液DNA（曲線11），以及ddH2O為模板的空白對(duì)照（曲線12）均無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象。該結(jié)果驗(yàn)證了模板的正確性，可以作為L(zhǎng)FNAA試紙條的結(jié)果的參考。

在LFNAA試紙條中，ASFV基因片段DNA和3份感染ASFV豬的血液DNA為陽(yáng)性模板，PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段，感染CSFV的豬血液DNA，和健康豬的血液DNA為陰性模板，ddH2O為空白對(duì)照（試紙條12）。從圖4b可以看出，3份感染ASFV豬的血液DNA在T線和C線上均有明顯的紅色條帶（試紙條2～4）與ASFV基因片段DNA（試紙條1）的檢測(cè)結(jié)果一致，表明了LFNAA的實(shí)用性。同時(shí)，感染CSFV的豬血液DNA（試紙條5），PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段（試紙條6～10），和健康豬的血液DNA（試紙條11）僅在C線出現(xiàn)一條紅色條帶，說(shuō)明了其陰性結(jié)果，證明了LFNAA的特異性。

該結(jié)果證明，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，LNFAA能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)出ASFV，而不會(huì)與其他病毒出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性的錯(cuò)誤判斷，這與OIE推薦的熒光定量PCR的結(jié)果一致。

1.ASFV的基因片段DNA；2~4.感染ASFV豬的血液DNA；5.感染CSFV豬的血液DNA；6~10.PRRSV、PCV1、PCV2、PRV、PPV的基因片段DNA；11.健康豬的血液DNA；12.ddH2O

3 結(jié) 論

為了滿足資源有限的實(shí)驗(yàn)室對(duì)ASFV的檢測(cè)需求，該研究開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、快速、低成本的檢測(cè)技術(shù)，可以用肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。

1）將膠體金試紙條技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)結(jié)合，能夠大大簡(jiǎn)化傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)。與常見(jiàn)的診斷試紙條相比，該測(cè)流核酸測(cè)定試紙條采用獨(dú)特的尾引物，能夠消除復(fù)雜的半抗原標(biāo)記的需要，無(wú)需昂貴的抗體，即可在檢測(cè)線上發(fā)生紅色反應(yīng)，用肉眼觀察目標(biāo)產(chǎn)物的存在。

2）將LFNAA體系應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，結(jié)果表明，該試紙條能夠特異性的鑒定出非洲豬瘟ASFV的樣品，靈敏度能達(dá)到103copies/L，與中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心認(rèn)可的ASFV檢測(cè)試劑盒的靈敏度相一致。

3）該技術(shù)能夠在2 h內(nèi)肉眼鑒定出結(jié)果，且操作簡(jiǎn)單，非常適合非專(zhuān)業(yè)人員操作，完全能夠滿足資源相對(duì)匱乏的實(shí)驗(yàn)室的低成本檢測(cè)。

由于該LFNAA技術(shù)的通用性，將來(lái)可以通過(guò)更換引物設(shè)計(jì)，即可應(yīng)用于其他食品安全檢測(cè)、環(huán)境污染分析和臨床診斷的檢測(cè)中；也可以引進(jìn)低成本的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)替換本技術(shù)中的PCR技術(shù)，使方法更進(jìn)一步簡(jiǎn)單快速方便，從而實(shí)現(xiàn)更快速便捷的現(xiàn)場(chǎng)鑒定。

[1]Sanchez-cordon P J, Montoya M, Reis A L, et al. African swine fever: A re-emerging viral disease threatening the global pig industry[J]. The Veterinary Journal, 2018, 233: 41－48.

[2]Ckillen J, Mcmenamy M, Hjertner B, et al. Sensitive detection of African swine fever virus using real-time PCR with a 5’ conjugated minor groove binder probe[J]. Journal of Virological Methods, 2010, 168(1/2): 141－146.

[3]Gallardo C, Fernandez-pinero J, Arias M. African swine fever (ASF) diagnosis, an essential tool in the epidemiological investigation[J]. Virus Research, 2019, 271: 197676.

[4]Zhao Jun, Bai Zhaohai, Ma Lin. China needs long-term solutions for African Swine Fever[J]. Science Bulletin, 2019, 64(20): 1469－1471.

[5]張洪培. 中獸醫(yī)溫病辨證與非洲豬瘟防控：非洲豬瘟防控知識(shí)簡(jiǎn)介[J]. 國(guó)外畜牧學(xué)（豬與禽），2019，39(8)：40－43.

[6]高瞻，張光磊，邵軍軍，等. 非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2019，36(9)：63－68.

Gao Zhan, Zhang Guanglei, Shao Junjun, et al. Research progress on diagnostic techniques for African swine fever[J]. Transactions of the Chinese Journal of Animal Quarantine, 2019, 36(9): 63-68. (in Chinese with English abstract)

[7]劉賀. 非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，40(7)：108－110.

Liu He. Progress on diagnostic techniques of African swine fever[J]. Transactions of the Chinese Journal of Progress in Veterinary Medicine, 2019, 40(7): 108－110. (in Chinese with English abstract)

[8]莊金秋，梅建國(guó)，謝金文，等. 非洲豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 飼料與畜牧，2017，(22)：32－36.

[9]張麗，羅玉子，王濤，等. 非洲豬瘟診斷技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與需求分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2019，21(9)：1－11.

Zhang Li, Luo Yuzi, Wang Tao, et al. Current progress and demand analysis of diagnostic technologies for African swine fever[J]. Transactions of the Chinese Journal of Agricultural Science and Technology, 2019, 21(9): 1－11. (in Chinese with English abstract)

[10]姜睿姣，張鵬飛，朱光恒，等. 非洲豬瘟檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2019，35(3)：523－532.

Jiang Ruijiao, Zhang Pengfei, Zhu Guangheng, et al. Diagnostic assays for African swine fever[J]. Transactions of the Chinese Journal of Virology, 2019, 35(3): 523－532. (in Chinese with English abstract)

[11]楊吉飛，關(guān)貴全，劉志杰，等. 一種用于非洲豬瘟病毒檢測(cè)的PCR方法[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42(8)：1201－1206.

Yang Jifei, Guan Guiquan, Liu Zhijie, et al. One PCR method used for detection of African swine fever virus[J]. Transactions of the Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2011, 42(8): 1201－1206. (in Chinese with English abstract)

[12]贠凱祎，向麗，王曉玥，等. 基于便攜式和CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀的冬蟲(chóng)夏草及其混偽品鑒定研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54(4)：746－752.

Yun Kaiyi, Xiang Li, Wang Xiaoyue, et al. Identification of ophiocordyceps sinensis and its adulterants based on portable and CFX96 real-time fluorescent PCR systems[J]. Transactions of the Chinese Journal of Acta Pharmaceutica Sinica, 2019, 54(4): 746－752. (in Chinese with English abstract)

[13]Gao Yao, Meng Xingyu, Zhang Huawei, et al. Cross-priming amplification combined with immunochromatographic strip for rapid on-site detection of African swine fever virus[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2018, 274: 304－309.

[14]吳海濤. 非洲豬瘟病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2015.

Wu Haitao. Development of Immunochromatographic Strip for the Detection of African Swine Fever Virus[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2015. (in Chinese with English abstract)

[15]Jauset-rubio M, Svobodova M, Mairal T, et al. Ultrasensitive, rapid and inexpensive detection of DNA using paper based lateral flow assay[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 37732.

[16]Sun Chen, Zhao Kui, Chen Keyan, et al. Development of a convenient immunochromatographic strip for the diagnosis of vesicular stomatitis virus serotype Indiana infections[J]. Journal of Virological Methods, 2013, 188(1/2): 57－63.

[17]Zsak L, Borca M V, Risatti G R, et al. Preclinical diagnosis of African swine fever in contact-exposed swine by a real-time PCR assay[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43(1): 112－119.

[18]Shi Xiju, Liu Xuming, Wang Qin, et al. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses[J]. Journal of Virological Methods, 2016, 236: 258－265.

[19]Xu Yuancong, Wei Yujun, Cheng Nan, et al. Nucleic acid biosensor synthesis of an all-in-one universal blocking linker recombinase polymerase amplification with a peptide nucleic acid-based lateral flow device for ultrasensitive detection of food pathogens[J]. Analytical Chemistry, 2018, 90(1): 708－715.

[20]Liu Lijing, Pan Haibo, Du Min, et al. Glassy carbon electrode modified with Nafion–Au colloids for clenbuterol electroanalysis[J]. Electrochimica Acta, 2010, 55(24): 7240－7245.

[21]Chen Yenting, Hsu Chiaoling, Hou Shaoyi. Detection of single-nucleotide polymorphisms using gold nanoparticles and single-strand-specific nucleases[J]. Analytical Biochemistry, 2008, 375(2): 299－305.

[22]Liu Chengche, Yeung Chunyan, Chen Pohao, et al. Salmonella detection using 16S ribosomal DNA/RNA probe-gold nanoparticles and lateral flow immunoassay[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2526－2532.

[23]喻正軍. 一種非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒制備方法及使用方法：108300808A [P]. 2018-02-23.

[24]楊鵬. 非洲豬瘟病毒核酸免提取熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒：110229932A [P]. 2019-06-20.

[25]李洪利，曹金山，王君瑋，等. 非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，39(6)：37－40.

Li Hongli, Cao Jinshan, Wang Junwei, et al. Construction and application of real-time quantitative PCR for detection of African swine fever virus[J]. Transactions of the Chinese Journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2012, 39(6): 37－40. (in Chinese with English abstract)

Rapid detection of African swine fever virus based on lateral flow nucleic acid assay

Wang Zhiying, Yu Wenjie, Xie Ruibin, Qiao Lu, Chen Ailiang※

(,,100081,)

African swine fever virus (ASFV) was a devastating contagion of swine that could cause 100% mortality of infected animals. The outbreak of ASFV in China in 2019 had caused great economic losses in the pig industry. Therefore, simple and rapid diagnostic technology was highly needed for ASFV prevention. However, most of the current detection methods, such as protein-based technology and fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR) technology, required complicated and expensive instruments, as well as professional technicians. Isothermal amplification technology did not require complex instruments but needed expensive reagents, which also limited its widespread usage, especially for laboratories with limited resources. In order to meet the needs of laboratories with limited resources to detect ASFV, a new low-cost lateral flow nucleic acid assay (LFNAA) was developed by combining the traditional PCR technique and the colloid gold lateral flow technique. LFNAA could observe the test results with naked eyes. A unique tailed-primer was designed to avoid the need for complicated antigen-labeling and expensive antibody, thus the PCR could produce a double-stranded DNA product with a single-strand oligonucleotide tail at one end, then the PCR product could hybridize with a colloidal gold-labeled oligonucleotide capture probe. In the presence of the positive product, the biotin on the other end of the product would bind to the streptavidin pre-immobilized on the test line of the strip and formed a sandwich structure of "streptavidin - biotin – PCR product - oligonucleotide tail - gold-labeled capture probe", so the test line of the strip would show a red color to indicate the positive result. On the other hand, if there was no positive product in the sample, the test line would show no red color. So, the detection result could be judged by observing whether the test line has a red color. Besides, the excess gold-labeled capture probe would hybridize with the control probe on the control line, showing a red color as an assay valid control. As a verification of the assay specificity, the LFNAA system was used to identify the presence of ASFV in actual samples of CSFV, PRRSV, PCV1 and PCV2, PRV, PPV. The result showed that the LFNAA could specifically detect ASFV, which was consistent with the fluorescent quantitative PCR. And the sensitivity of the LFNAA was the same with the agarose gel electrophoresis, both could reach to 103copies/L. Therefore, the LFNAA can meet the requirements of rapid and sensitive ASFV identification with only a common PCR instrument. Its rapidity (<2 h), low-cost, and simple-operation are greatly suitable for the non-professionals in the laboratories with limited resources. LFNAA avoids the usage of the expensive antibody and the complicated process of AuNP-antibody conjugation. Furthermore, due to the generality of the technique, the more simple isothermal amplification technology is expected to replace the current PCR method to make it more convenient and simple, and realizes faster and easier field testing in food safety testing and medical diagnosis.

animal; aquaculture; African swine fever virus (ASFV); traditional PCR technique; lateral flow nucleic acid assay (LFNAA); tailed-primer; low-cost

王之瑩，于文杰，謝瑞彬，喬 璐，陳愛(ài)亮. 利用側(cè)流核酸試紙條快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(4)：294－299.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.035 http://www.tcsae.org

Wang Zhiying, Yu Wenjie, Xie Ruibin, Qiao Lu, Chen Ailiang. Rapid detection of African swine fever virus based on lateral flow nucleic acid assay[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(4): 294－299. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.035 http://www.tcsae.org

2019-11-04

2020-01-01

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃2017YFC1601700

王之瑩，河南駐馬店人，主要從事食品安全檢測(cè)研究。 Email：1017258976@qq.com※

陳愛(ài)亮，山東人，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測(cè)研究。Email：ailiang.chen@gmail.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.035

S858.28

A

1002-6819(2020)-04-0294-06