(鞍山市腫瘤醫(yī)院化療四病區(qū), 遼寧 鞍山 114000)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neurocytoma，NB)多發(fā)生在腎上腺、腹部、胸部、頸部等神經(jīng)組織，并且其惡性程度高、病情多變、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)，所以治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤比較困難，患者死亡率高，預(yù)后差[1-3]，因此，治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤關(guān)鍵是抑制其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，以提高病人的生存率。Let-7是一類(lèi)高度保守的miRNA分子，最早發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(chóng)中。研究發(fā)現(xiàn)[4]，Let-7具有腫瘤抑制基因的作用，它可調(diào)節(jié)c-myc、ras等基因表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗癌的作用。而Let-7能否用于治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本文考察了miRNA Let-7對(duì)SH-SY5Y(神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物有限公司，Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase 3抗體購(gòu)自Abcam(英國(guó))，DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen。相差顯微鏡(日本Nikon)，熒光定量PCR儀購(gòu)自Step oneplus PCR System(ABI)，引物沈陽(yáng)鼎國(guó)生物公司合成捷基合成(見(jiàn)表1)。

1.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞[5]

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞以4×105個(gè)/孔鋪于6孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到30%～40%時(shí)，將50 nmoL/L的siRNA-Let-7或si-NC加入Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染到神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，具體步驟參照說(shuō)明書(shū)，充分混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，然后進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 各引物序列

1.3 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況[6]

具體步驟為細(xì)胞鋪96孔板并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，加入試劑盒中相關(guān)試劑進(jìn)行反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Real time PCR法測(cè)定各組細(xì)胞中Let-7 mRNA含量及Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax的mRNA水平[7]

具體步驟如下：采用總RNA的提取試劑盒(RNA Isolation Kit)提取RNA，并采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA純度和濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RNA First-Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，60 ℃反應(yīng)40 s，30個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t計(jì)算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞的侵襲遷移能力[8]

小室采用紫外線照射殺菌，小室中加入一定量的細(xì)胞懸液(1.0×108/L)。下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)到時(shí)間后用干棉簽將上室內(nèi)的液體擦掉，用蒸餾水浸濕的棉簽擦掉表面的細(xì)胞。下室內(nèi)的細(xì)胞用中性甲醛固定30 min，用結(jié)晶紫染色，采用相差顯微鏡拍照觀察，并對(duì)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況[8]

收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉，分別以Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為二抗，涂ECL發(fā)光液在凝膠成像儀中成像。以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行吸光度值分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中miRNA Let-7的表達(dá)情況比較

采用PCR法檢測(cè)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y中miRNA Let-7的表達(dá)情況，與未轉(zhuǎn)染組相比，si-NC轉(zhuǎn)染組miRNA Let-7 mRNA含量(1.05±0.12vs1.13±0.18)無(wú)顯著差異(P>0.05)，siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組miRNA Let-7 mRNA含量顯著減少(1.05±0.12vs0.34±0.19)(P<0.05)。與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組Let-7 mRNA含量顯著減少(1.13±0.18vs0.34±0.19)(P<0.05)。

2.2 miRNA Let-7對(duì)各組細(xì)胞增殖的影響

采用重復(fù)測(cè)量方差分析細(xì)胞不同時(shí)間段吸光度值。結(jié)果顯示：(1)三組細(xì)胞吸光度值隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)(F=22.510，P<0.001)；(2)三組細(xì)胞吸光度值組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.200，P<0.019)，其中siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸光度值顯著高于未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組(P<0.05)；(3)三組細(xì)胞吸光度值不存在時(shí)間和組間的交互作用(F=1.510，P=0.261)，即各組細(xì)胞吸光度值隨時(shí)間變化趨勢(shì)與分組無(wú)關(guān)。

表2 各組細(xì)胞不同時(shí)間段吸光度值比較

與未轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.05；與si-NC轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

2.3 miRNA Let-7對(duì)各組細(xì)胞的遷移、侵襲狀況

采用tranwell小室模型檢測(cè)了SH-SY5Y細(xì)胞的遷移、侵襲狀況，結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)染組和si-NC轉(zhuǎn)染組tranwell小室中細(xì)胞的數(shù)量明顯比siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組少，排列稀疏(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果(×400)A：未轉(zhuǎn)染組；B：si-NC轉(zhuǎn)染組；C：siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組

2.4 PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax的mRNA表達(dá)情況

與未轉(zhuǎn)染組相比，si-NC轉(zhuǎn)染組Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax mRNA含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組Bcl-2 mRNA含量顯著減少，Cleaved casp-3、Bax mRNA含量顯著增多(P<0.05)；與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，Bcl-2 mRNA含量顯著減少，siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組Cleaved casp-3、Bax mRNA含量顯著增多(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 各組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax mRNA含量比較

與未轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.05；與si-NC轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

2.5 各組細(xì)胞Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax 蛋白的表達(dá)

各組Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax蛋白的表達(dá)如圖2所示，相對(duì)密度分析結(jié)果表明(見(jiàn)表4)。與未轉(zhuǎn)染組相比，si-NC轉(zhuǎn)染組Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，Cleaved casp-3、Bax蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；與si-NC轉(zhuǎn)染組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，siRNA-Let-7Cleaved casp-3、Bax蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。

3 討 論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部位，是嬰幼兒最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高度侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移特性等特性，其得病率僅次于白血病和腦腫瘤。神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移常見(jiàn)于骨、腦、肺和全身骨髓轉(zhuǎn)移等，大部分患者死于全身骨髓轉(zhuǎn)移，所以治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵是抑制其增殖及轉(zhuǎn)移[8]。研究表明，抑制Let-7 miRNA表達(dá)可使細(xì)胞增殖能力明顯下降[9-11]，提示Let-7與腫瘤發(fā)生有一定得聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中Let-7高表達(dá)，順轉(zhuǎn)siRNA-Let-7后Let-7在細(xì)胞中的量會(huì)明顯的減少，推測(cè)Let-7含量減少后可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡等造成影響。

圖2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況A：未轉(zhuǎn)染組；B：si-NC轉(zhuǎn)染組；C：siRNA-Let-7轉(zhuǎn)染組

表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Cleaved casp-3、Bax蛋白含量比較

與未轉(zhuǎn)染組比較，aP<0.05；與si-NC轉(zhuǎn)染組比較，bP<0.05

腫瘤的增殖活性與其生物學(xué)密切相關(guān)，增殖活性越高，其惡性程度就越高，轉(zhuǎn)移的可能性越大，并且難治療[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾Let-7表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，說(shuō)明Let-7對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的增殖起抑制作用。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的特點(diǎn)是骨髓的轉(zhuǎn)移率高，早期就會(huì)發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，治療效果不佳，本實(shí)驗(yàn)采用Transwell趨化侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SH-SY5Y細(xì)胞遷移及侵襲能力，結(jié)果表明，干擾Let-7在細(xì)胞中表達(dá)，SH-SY5Y細(xì)胞的遷移侵襲能力增強(qiáng)，說(shuō)明SiRNA-Let-7對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲起到抑制作用。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞的程序化死亡方式，其是一把雙刃劍，在細(xì)胞的生命周期中起重要的作用。細(xì)胞的凋亡受到細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是抗凋亡基因，一類(lèi)是促凋亡基因。Bcl-2是一種抗凋亡基因，其過(guò)表達(dá)能使細(xì)胞的凋亡減少。Bax是一類(lèi)促凋亡基因，其過(guò)度表達(dá)時(shí)，可形成大量的Bax-Bax同源二聚體，使細(xì)胞凋亡增多；Bcl-2對(duì)Bax起到對(duì)抗作用，當(dāng)Bcl-2的生成增多時(shí)，會(huì)使Bax-Bax同源二聚體分開(kāi)，使之與Bcl-2結(jié)合，進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡[13]。Caspase-3是調(diào)控凋亡的核心蛋白，也被稱為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白，一旦Caspase-3被激活形成Cleaved casp-3，即預(yù)示著凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Let-7在SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)減少后，Cleaved casp-3、Bax mRNA含量會(huì)增多，Bcl-2 mRNA含量減少，Let-7對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡也有促進(jìn)作用。

綜上所述，Let-7在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)減少后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖遷移侵襲及凋亡，說(shuō)明Let-7對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤有抑制作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。該研究為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療提供了更多的可能性。