(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科,廣東 深圳 518000; 2.深圳市婦幼保健院中心實驗室,廣東 深圳 518000; 3.深圳康寧醫(yī)院檢驗科,廣東 深圳 518000)

先天性甲狀腺功能衰退癥是臨床最常見的新生兒內(nèi)分泌疾病之一，會引起自身代謝障礙、生理功能低下及智力障礙等問題[1-3]，其主要發(fā)病原因為患兒的甲狀腺激素合成減低或發(fā)育不全引起[4-5]，碘元素代謝以及甲狀腺激素合成與分泌等過程的基因突變與甲狀腺激素合成低下具有密切關(guān)系。既往有研究表明，雙氧化酶2(dualoxidase2，DUOX2)基因突變會導(dǎo)致先天性甲狀腺功能衰退癥的發(fā)生[6-8]。同時，研究表明，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins-3, IGFBP-3)水平會對生長發(fā)育水平產(chǎn)生影響[9-10]，推測甲狀腺激素水平與IGFBP-3水平存在某種關(guān)聯(lián)。故本研究選取100例先天性甲狀腺功能衰退癥患兒的臨床資料進(jìn)行回顧性研究分析，探討先天性甲狀腺功能衰退癥患兒相關(guān)基因突變以及IGFBP-3蛋白表達(dá)水平。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年6月100例先天性甲狀腺功能衰退癥患兒作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)嬰幼兒篩查中促甲狀腺激素超過20 μIU/mL；(2)先天性甲狀腺功能衰退癥患兒診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《2014年歐洲兒科內(nèi)分泌學(xué)會先天性甲狀腺功能減退癥指南介紹》[11]；(3)患兒甲狀腺位置正常且腫大；(4)患兒監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)新生兒未合并其他嚴(yán)重疾??；(2)患兒家屬依從性差。選取入組的100例先天性甲狀腺功能衰退癥患兒作為觀察組，年齡范圍為2個月至3歲，平均年齡為(1.76±0.55)歲，平均出生體重(3449.00±452.35)g；其中男性21例，女性79例；選取同期67例正常嬰幼兒作為對照組，年齡范圍為2個月至3歲，平均年齡為(1.69±0.58)歲，平均出生體重(3456.00±452.66)g；其中男性14例，女性53例；比較兩組患者平均年齡、平均出生體重以及性別等一般資料差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究內(nèi)容經(jīng)我院倫理學(xué)會批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 方法

采集嬰幼兒外周靜脈血5 mL放置于檸檬酸鈉抗凝管中，采用貝克曼DNA提取試劑盒進(jìn)行全血清提取患兒外周血基因，并利用微量紫外分光光度計對提取的患兒DNA進(jìn)行純度以及濃度檢測，其中OD數(shù)值提示為1.79至1.98之間，濃度不低于60.0 ng/μL，濃度最高不超過368.8 ng/μL。根據(jù)系統(tǒng)軟件設(shè)計引物擴(kuò)增DUOX2外顯因子，其合成引物由系統(tǒng)對應(yīng)公司提供，見表1。其PCR反應(yīng)體系是由20μLPCR反應(yīng)緩沖液中含有200 nM dNTPs進(jìn)行反應(yīng)，在80 ng DNA模板上，其上、下游引物分為為0.5 μM以及1.25 U Taq聚合酶，其PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，55至65 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 7 min，降溫至4℃。PCR產(chǎn)物使用同位素標(biāo)記法對基因進(jìn)行測序。所有嬰幼兒于入院清晨空腹采集靜脈血5 mL，經(jīng)過離心后分離血清測定IGFBP-3，采用DRG International公司免疫放射試劑盒(型號：FREE-001)以及中科中佳科學(xué)儀器有限公司的γ免疫計數(shù)器(型號：GC-911)進(jìn)行檢查。

表1 DUOX2基因的引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)資料均采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用的形式表示，行正態(tài)性和方差齊性檢驗后，組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DOUX2基因外顯因子結(jié)果

有10例先天性甲狀腺功能衰退癥患兒存在DUOX2基因第28外顯因子發(fā)現(xiàn)基因突變，有30例先天性甲狀腺功能衰退癥患兒存在DUOX2基因第17外顯因子發(fā)現(xiàn)基因突變，其他先天性甲狀腺功能衰退癥患兒均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因突變。經(jīng)過生物信息學(xué)分析表明，DUOX2第28外顯子會導(dǎo)致精氨酸變?yōu)榻M氨酸，見圖1；DUOX2第17外顯子會導(dǎo)致組氨酸變?yōu)榫彼?，見圖2。

2.2 兩組IGFBP-3水平

與正常對照組相比，觀察組患兒IGFBP-3水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明先天性甲狀腺功能衰退癥患兒存在IGFBP-3水平不足，見表2。

圖1 DOUX2第28外顯因子部分測序圖觀察組基因突變測序圖，其突變點為A/G雜合雙峰；對照組基因測序圖為GG符合

圖2 DOUX2第17外顯因子部分測序圖觀察組基因突變測序圖，其突變點為C/T雜合雙峰；對照組基因測序圖為GG符合

表2 兩組患兒IGFBP-3水平

與對照組相比，aP<0.05

3 討 論

先天性甲狀腺功能衰退癥是新生兒最常見的內(nèi)分泌疾病之一，早期缺乏典型臨床癥狀表現(xiàn)，但如果不能對患兒進(jìn)行及時診斷以及正確治療，會對患兒的神經(jīng)、骨骼等系統(tǒng)的生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響[12-15]。新生兒先天性甲低經(jīng)過早期篩查能夠及時診斷以及治療其疾病[16-18]。先天性甲狀腺功能衰退癥的病因有甲狀腺缺乏、發(fā)育不良或異位等障礙，然而大多數(shù)患兒的發(fā)病機(jī)制尚不明確。碘元素的氧化以及有機(jī)化是甲狀腺激素合成的主要緩解以及限速階段，該過程需要TO以及H2O2的參與。H2O2由DUOX2基因催化形成，若DUOX2在過程中發(fā)生突變，造成合成H2O2的功能缺失，進(jìn)而導(dǎo)致碘元素不能氧化以及有機(jī)化，進(jìn)而導(dǎo)致先天性甲狀腺功能衰退癥[19]。

隨著研究逐漸開展，已發(fā)現(xiàn)多種不同類型的DUOX2的基因突變。本次研究中有10例先天性甲狀腺功能衰退癥患兒存在DUOX2基因第28外顯因子發(fā)現(xiàn)基因突變以及有30例存在第17外顯因子發(fā)現(xiàn)基因突變。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，DUOX2第17、28外顯子發(fā)生氨基酸突變，導(dǎo)致患兒蛋白質(zhì)的改變。但新生兒胎兒期的生長發(fā)育與正常胎兒無明顯差別，考慮胎兒期來自母體的甲狀腺素基本能夠保證胎兒的生長發(fā)育，羊水中的細(xì)胞因子能夠有效防止患兒出現(xiàn)甲狀腺缺乏引起的嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害以及骨骼出現(xiàn)異常，同時能夠解釋患兒為何在新生兒期尚缺特征性癥狀。而出生后不久的新生兒IGFBP-3表達(dá)水平出現(xiàn)降低。本次研究結(jié)果顯示，觀察組患兒IGFBP-3水平明顯低于對照組；提示先天性甲狀腺功能衰退癥患兒的蛋白水平會受到影響，其主要考慮因素仍是患兒基因突變導(dǎo)致患兒蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)功能不全，故提示DUOX2基因的突變可能引起蛋白質(zhì)功能的改變進(jìn)而影響IGFBP-3的合成，傳導(dǎo)或者表達(dá)導(dǎo)致先天性甲狀腺功能衰退癥。IGFBP-3水平出現(xiàn)降低可能是患兒出生后出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩的原因，并且，部分學(xué)者研究表明[20-21]，若短期替代治療，能使IGFBP-3正常，能夠保證甲狀腺激素能恢復(fù)到正常水平，使患兒正常生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)先天性甲低患兒IGFBP-3水平降低，并且DUOX2基因會發(fā)生突變，結(jié)合現(xiàn)有學(xué)者研究成果，DUOX2基因突變可認(rèn)定為導(dǎo)致IGFBP-3水平降低的主要原因，是導(dǎo)致甲狀腺激素分泌不足，造成患兒生長發(fā)育遲緩，采取相關(guān)治療提高患兒IGFBP-3水平，對患兒進(jìn)行IGFBP-3水平的早判斷以及治療具有重要臨床意義。