王鳳云，王 卓，王曉玉，李衛(wèi)東，鄧向亮，韓 亮＊＊

（1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院 廣州 510006；2. 廣東藥科大學(xué)健康學(xué)院 廣州 510006；3. 廣東藥科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 廣州 510006；4. 廣東省光與健康工程技術(shù)研究中心 廣州 510310）

炎性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一種臨床較為常見的慢性特發(fā)性腸道炎癥性疾病，其主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、大便膿血等，主要包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）。雖然IBD 的病因及發(fā)病機制尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但近期研究表明遺傳因素、腸道微生態(tài)、黏膜免疫與環(huán)境因素等對IBD 的發(fā)病起著關(guān)鍵作用[1]。水楊酸抑制劑、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等為IBD 治療的常規(guī)藥物，它們在一定程度上可緩解及改善IBD 的癥狀，但長期療效欠佳，患者往往會因長期服用而出現(xiàn)藥物耐受性及不良反應(yīng)，不利于疾病的控制。隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展，臨床醫(yī)師發(fā)現(xiàn)中藥治療IBD 具有一定優(yōu)勢，不僅可以緩解改善IBD 的癥狀還可以提高患者的免疫力，比較適合新藥研究開發(fā)。IBD 屬于中醫(yī)“腸癰”“痢疾”“腸澼”等范疇，其關(guān)鍵病機為濕、淤、熱三邪內(nèi)阻于胃腸，使脾失健運、升降失司，淤濁留于胃腸道久久不去[2-3]。敗醬草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性微寒，味苦、辛，歸肺、大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫排膿、活血祛瘀之功，主治腸癰、癰腫瘡毒、腹痛等。本課題組已初步驗證敗醬草提取物可以下調(diào)TNF 與IL-1β，緩解大鼠結(jié)腸的組織學(xué)損傷，但具體作用機制尚未得到系統(tǒng)闡述[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于基因組、化學(xué)組、轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)的一門學(xué)科，廣泛應(yīng)用于預(yù)測單味中藥或復(fù)方作用機制?；诖?，本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法系統(tǒng)研究敗醬草治療IBD的活性成分及其作用靶點。

1 材料與方法

1.1 敗醬草活性成分與成分靶點

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP）（http://tcmspw.com/）篩選敗醬草活性成分及靶點，篩選條件為口服生物利用度（OB ≥20%）、藥物相似性（DL ≥0.1）；同時結(jié)合PharmMapper 數(shù)據(jù)庫進行反向?qū)荧@得成分靶點。

1.2 IBD靶點及交集靶點

以“inflammatory bowel disease”或“inflammatory bowel disease AND Homo sapiens”為 關(guān) 鍵 詞，檢 索Genecards、NCBI、CooLGeN 數(shù)據(jù)庫挖掘IBD 靶點，其中Genecards 數(shù)據(jù)庫按照Gifts ≥50，NCBI 數(shù)據(jù)庫中只選取來源OMIM 數(shù)據(jù)庫的靶點。成分靶點與IBD 靶點使用jvenn在線分析工具分析來獲得交集靶點。

1.3 交集靶點的PPI分析

使用STRING 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行PPI 分析，high confidence ≥0.700，其他為默認(rèn)設(shè)置。運用Cytoscape3.6.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 交集靶點的GO與KEGG通路富集分析

運 用Cytoscape3.6.1 中ClueGO 與CluePedia 插 件進行GO 與KEGG 通路富集分析，其條件為：Show only Pathways with pV ≤0.01、Min Level = 6、Max Level = 8、Min #Genes = 6、Kappa Score = 0.5，其余為默認(rèn)設(shè)置。

1.5 分子對接驗證

選取PPI 中度值前5 靶點與敗醬草活性成分進行分子對接，采用能量打分函數(shù)來評價配體與受體的結(jié)合程度，其打分值越小，說明活性成分配體分子與靶點受體分子的結(jié)合越緊密。

2 結(jié)果

2.1 敗醬草活性成分與成分靶點

根據(jù)1.1 篩選條件，整理后獲得敗醬草活性成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚等16 個成分（表1）。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得活性成分的mol2 文件后使用同PharmMapper[5]數(shù)據(jù)庫進行反向?qū)?，設(shè)置條件選擇Human Protein Targets，其余為默認(rèn)，對接結(jié)果按照Norm Fit ≥0.9 進行篩選；匯總TCMSP 與PharmMapper數(shù)據(jù)庫所預(yù)測的成分靶點，刪除重復(fù)項后獲得PIM1、AR、PTGS2、BCHE、CA2 等184 個 靶 點，使 用Cytoscape3.6.1構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。成分-靶點網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治龊螅l(fā)現(xiàn)槲皮素（Degree = 81）、Bolusanthol B（Degree=63）、β-谷甾醇（Degree=50）等有較高連接度，這說明敗醬草中活性成分治療IBD 可能是通過調(diào)控多個靶點來起作用的。

表1 敗醬草活性成分

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 敗醬草活性成分-靶點圖

圖2 “敗醬草-IBD”交集靶點

2.2 IBD靶點及交集靶點

按照1.2 的條件進行IBD 靶點挖掘分析，其中Genecards數(shù)據(jù)庫獲得359個靶點，NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得來源OMIM 數(shù)據(jù)庫的靶點673 個，在CooLGeN 數(shù)據(jù)庫進行挖掘獲得136 個靶點，整合3 個疾病數(shù)據(jù)庫所獲得靶點、去除重復(fù)靶點得到IBD 靶點有977個，其中87個靶點與成分靶點出現(xiàn)交集（圖2）。

2.3 交集靶點PPI分析

將交集靶點導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，分析條件：High confidence 為0.700，其余為默認(rèn)設(shè)置。分析結(jié)果保存為TSV文件并運用Cytoscape3.6.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），最終獲得82 個靶點存在蛋白互作關(guān)系，其中前5 度值的靶點為IL6、TP53、MAPK1、VEGFA、MAPK8（表2）。

2.4 交集靶點GO富集分析

根據(jù)1.4 的條件，獲得與IBD 相關(guān)GO Term 有44條，根據(jù)P值來判斷富集的顯著性，其中顯著性排名前5 的主要是細(xì)胞遷移調(diào)控（GO:0030335）、脂多糖反應(yīng)（GO:0032496）、炎癥反應(yīng)（GO:0050727）、外源性凋亡信號通路（GO:0097191）、核受體激活（GO:0004879）（表3）。運用CluePedia 插件構(gòu)建GO 生物學(xué)功能網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。通過研究發(fā)現(xiàn)，靶點與生物學(xué)功能形成了復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，一個靶點可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，而一種生物學(xué)功能同時也會存在多個靶點富集的現(xiàn)象，這提示敗醬草治療IBD 可能是通過調(diào)控多靶點來調(diào)節(jié)多種生物功能而起作用。

2.5 交集靶點KEGG富集分析

根據(jù)1.4 的條件，進行KEGG 富集分析，獲得與IBD 相關(guān)的通路有32 條，其顯著性按照P Value 值的大小來排序，顯著性前5 通路主要涉及了癌癥通路、AGE-RAGE 信號通路、流體剪應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、IL-17 信號通路、TNF 信號通路（表4）。通過使用CluePedia 插件構(gòu)建KEGG 通路富集功能網(wǎng)絡(luò)圖，將靶點與通路之間的關(guān)系進行可視化（圖5）。這些主要通路往往會出現(xiàn)多個靶點與之形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，說明敗醬草治療IBD 可能通過作用多個靶點來進行多通路調(diào)節(jié)，從而減輕炎性浸潤、腸道血管粘連、癌變等。

表2 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析

圖3 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接驗證

選取PPI 中度值前5 靶點與敗醬草活性成分進行分子對接驗證，對接所需的受體文件從PDB 數(shù)據(jù)庫獲得，靶點IL6（PDB ID:1ALU）、TP53（PDB ID:3D06）、MAPK1（PDB ID:4ZZN）、VEGFA（PDB ID:1MMK）、MAPK8（PDB ID:2XRW），所有受體文件均做刪除原配體、水分子及加氫加電荷處理，配體分子為敗醬草活性成分，選擇柳氮磺砒啶（Sulfasalazine）作為陽性對照藥物。使用iGEMDOCKv2.1 進行對接，對接結(jié)合程度使用能量打分函數(shù)來評價，打分越低，說明活性成分與靶點受體結(jié)合越緊密。敗醬草活性均能前5靶點結(jié)合（圖6），其中蒙花苷（Linarin）與IL6 結(jié)合程度較敗醬草其他化合物緊密；灰綠曲霉酰胺（Asperglaucide）與靶點TP53、西托糖苷（Sitogluside）與靶點MAPK1 結(jié)合較好；黃草烏堿丙（Vilmorrianine C）與靶點VEGFA、異葒草素（Isoorientin）與MAPK8 結(jié)合較好。與陽性對照藥柳氮磺砒啶，這些化合物與前5 靶點結(jié)合方式較為相似，均落于靶點受體的活性中心內(nèi)（圖7）。使用軟件Ligplot 計算得到靶點相互作用2D 模式圖，其中化合物蒙花苷與IL6 中的氨基酸殘基Gln159 形成氫鍵，與Gln152、Gln156、Gln154、Ala153、Arg104、Glu106、Asp160 等殘基有疏水作用（圖8A）；而柳氮磺砒啶則與靶點IL6 中的Arg182、Glu172 殘基形成氫鍵，與Leu178、Ser176、Arg179、Gln175等殘基存在疏水作用，其余靶點解讀同IL6（圖8、圖9）。

表3 交集靶點GO富集分析

圖4 GO生物學(xué)功能網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 KEGG通路富集功能網(wǎng)絡(luò)圖

表4 交集靶點KEGG富集分析

3 討論

全球疾病負(fù)擔(dān)研究報告報道，中國IBD 發(fā)病率逐年上升，預(yù)計2025年將高達150萬例[6]。由于IBD發(fā)病具有癥狀多樣性、非特異性、發(fā)病較為隱匿、病因不明確等特點，給臨床治療帶來很大的難度，如何做到個體化治療或未病先防是目前有待解決的醫(yī)療難度。中醫(yī)可根據(jù)IBD 患者體質(zhì)的差異進行辨證施治，同時還能做到未病先防，在治療IBD方面具有獨特的優(yōu)勢。中醫(yī)認(rèn)為IBD 患者與體內(nèi)濕熱淤毒有關(guān)，臨床治療大法多以清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛為主。敗醬草辛散苦泄寒涼，既能清熱解毒又能消癰排膿、活血止痛，常與薏苡仁、附子等配伍來治療CD 與UC[7,8]，為治療腸癰腹痛首選藥物?；诖耍狙芯渴褂镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的方法對敗醬草治療IBD的潛在作用機制及靶點。

圖6 分子對接能量打分熱圖

圖7 藥物與前5靶點分子對接3D模式圖

圖8 靶點-化合物相互作用2D模式圖

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行活性成分挖掘研究發(fā)現(xiàn)，敗醬草潛在活性成分有16 種，如槲皮素（Quercetin）、芹菜素（Apigenin）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Kaempferol）、β-谷甾醇（Beta-sitostero）、西托糖苷、異葒草素等。槲皮素是一種類黃酮，具有抗?jié)儭⒖寡趸?、抗癌等多種活性；現(xiàn)代藥理表明，槲皮素對乙酸誘導(dǎo)IBD 大鼠有保護作用，因其可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來降低局部炎癥及促進出血性病變部位的愈合[9]。JU[10]等發(fā)現(xiàn)槲皮素可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)擬桿菌、放線菌、變形菌門等來恢復(fù)腸道菌群的平衡，同時還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞抗炎及殺菌作用來改善結(jié)腸炎。MASCARAQUE[11]等發(fā)現(xiàn)芹菜素對三硝基苯磺酸（TNBS）與葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)IBD模型均有改善作用，使炎癥區(qū)域減少、降低髓過氧化物酶（MPO）的含量，同時還可以使結(jié)腸炎癥標(biāo)志物IL6、趨化因子CCL2 的表達水平趨向正?；?。人前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2/COX2）是花生四烯酸代謝途徑的限速酶，與IBD 的腸運動障礙密切相關(guān)[12]。NUNES[13]等發(fā)現(xiàn)木犀草素可以抑制IL8、一氧化氮合酶（INOS）、COX 的表達，調(diào)節(jié)腸道炎癥信號級聯(lián)反應(yīng)，其抗炎機制與JAK/STAT 信號通路的抑制有關(guān)。山奈酚、β-谷甾醇是中藥材中較為常見的化合物單體，具有抗炎、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛、促進傷口愈合等藥理活性。肖志彬[14]等發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可增強機體氧自由基（OFR）清除能力及調(diào)控血清NO 含量及TNF-α 炎性因子，進而減輕阿司匹林對胃黏膜損傷。研究表明，山奈酚可調(diào)控LPS 誘導(dǎo)IBD 小鼠TNF-α、IL-1B（β）、IL6、血管細(xì)胞黏附分子（VCAM1）等的表達，其治療IBD 可能與Toll 樣受體4（TLR4）、NF-κB 和STAT 信號通路負(fù)調(diào)控有關(guān)[15]。通過分子對接發(fā)現(xiàn)，除了已有文獻證明的活性成分，還發(fā)現(xiàn)西托糖苷、異葒草素、蒙花苷、灰綠曲霉酰胺、黃草烏堿丙等成分與靶點蛋白的結(jié)合能較低，與陽性藥物柳氮磺砒啶較為相似，這可為敗醬草治療IBD的深入研究及開發(fā)提供理論參考。

圖9 靶點-化合物相互作用2D模式圖

將敗醬草成分對應(yīng)的靶點與IBD疾病取交集進行PPI蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，IBD作用靶點主要涉及了IL6、TP53、MAPK1、VEGFA、MAPK8、JUN、TNF、EGFR、IL1B、PTGS2、CCL2、VCAM1 等。研究表明，腸黏膜屏障系統(tǒng)與IBD 的發(fā)病有著重要的聯(lián)系，它一旦被破壞就有大量細(xì)菌就侵入內(nèi)黏液層，造成宿主感染[16]。TNF-α、IL1β、IL6 等炎癥因子可以損傷腸黏膜屏障系統(tǒng)，破壞腸道穩(wěn)態(tài)，引起腸源性感染、內(nèi)毒素被大量吸收入血[17,18]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的關(guān)鍵傳遞者，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡和死亡等生理過程，可激活多種信號通路，廣泛存在于真核細(xì)胞中。GAO[19]等發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)MAPK家族中MAPK1、MAPK8可以減輕結(jié)腸炎癥及減少細(xì)胞凋亡。何馥倩[20]等發(fā)現(xiàn)通過阻斷p38MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可降低促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的釋放。研究表明，血管生成是IBD的發(fā)病原因之一，其步驟主要包括內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的刺激；基底膜降解與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解；EC 的增殖、遷移、黏附；新血管與血管網(wǎng)的重塑[21]。VEGFA 是血管內(nèi)皮生長因子主要成員之一，可使血管的通透性增加及刺激EC 增殖、定向遷移及分化。

交集靶點進行GO 富集發(fā)現(xiàn)，敗醬草治療IBD 主要涉及細(xì)胞遷移、脂多糖反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、核受體活性等生物學(xué)功能，而且每種生物功能與靶點的作用都是個復(fù)雜生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，同時也說明敗醬草治療IBD并非是單靶點或一種生物功能在起作用。KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)，交集靶點主要涉及了32條，其中癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、NF-κB信號通路、IL-17信號通路、TNF 信號通路等參與了IBD 的血管生成、炎癥產(chǎn)生、免疫調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)歸為結(jié)腸癌等生理過程[22-25]。

本課題組基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接方法對敗醬草治療IBD 藥理機制系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)了槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇等已有文獻驗證的活性成分，還發(fā)現(xiàn)了西托糖苷、異葒草素、蒙花苷、灰綠曲霉酰胺、黃草烏堿丙等成分有潛在研究價值，這為敗醬草在治療IBD方面的藥物研究開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。