郝媛媛，劉 妍，李翠茹，高懷林

（1. 河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合學院 石家莊 050200；2. 河北中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 石家莊 050200；3. 河北以嶺醫(yī)院 石家莊 050091；4. 絡(luò)病研究與創(chuàng)新中藥國家重點實驗室 石家莊 050035）

現(xiàn)代社會物資豐富，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，由于能量攝入過剩造成的脂代謝異常人口增多。內(nèi)皮功能障礙與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其介導的細胞凋亡相關(guān)，高血糖、氧化應激、缺氧、鈣超載等均會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[1]。此外，研究表明，心血管疾病、肥胖、炎癥等均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激關(guān)系密切[2,3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蛋白質(zhì)翻譯、折疊、運輸?shù)募毎?，在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）是一種細胞自我保護機制[4]，以適應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生。早期通過減少蛋白質(zhì)的合成，增加蛋白質(zhì)的折疊和轉(zhuǎn)運速度來恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，但如果損傷過于嚴重，適應機制不足以處理未折疊蛋白負荷，ERs會引起細胞凋亡[5]。過度或長時間的ERS 能通過激活CHOP、JNK、Caspase12以及bcl-2家族引起的細胞凋亡[6,7]。

在脈絡(luò)學說營衛(wèi)理論為指導下，探討“營衛(wèi)不通，血凝不流”的基本病機，依據(jù)中醫(yī)學的“脈”與西醫(yī)學的“血管”在解剖形態(tài)上具有同一性，將在動、靜脈中發(fā)生的多種血管疾病統(tǒng)稱為“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”[8]。內(nèi)皮細胞作為微血管的基本構(gòu)成單位，在心血管事件鏈中發(fā)揮重要作用。本研究采高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J 小鼠，通心絡(luò)遵循了“絡(luò)以通為用”的治療原則進行干預,觀察其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的細胞凋亡的影響，以評價通心絡(luò)對肥胖模型下小鼠的防治效果及血管內(nèi)皮功能的保護作用。

1 材料

1.1 動物

5-6 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠45 只，體質(zhì)量18-22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（京）2016-0006），實驗動物飼養(yǎng)于河北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)藥研究院新藥評價中心。溫度22-24℃，濕度50-60%，每籠5只，12 h明暗交替，自由進食飲水。

1.2 主要試劑

總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（北京九強生物技術(shù)有限公司）；去甲腎上腺素（NE，天津金耀氨基酸有限公司）；乙酰膽堿（Ach，美國Sigma 公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，阿拉丁）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo scientific 公司）；PSS 碳酸鹽緩沖液,KPSS 碳酸鹽緩沖液;Eastep?Super總RNA提取試劑盒（美國Promega公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司）；GRP78 抗體、Caspase-9 抗體（Abcam 公司）；Caspase-3抗體、Caspase-7抗體（CST 公司）；引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.3 實驗儀器

DMT 620四通道微血管張力測定儀（DMT，丹麥），PowerLab 生物信號采集分析系統(tǒng)（AD instruments Co，Australia），顯微鏡，顯微手術(shù)解剖工具（Geuder，德國），電子天平（JA12002，上海越平科學儀器有限公司），微量移液器（Corning，美國），恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司），純水儀（A10，Thermo），無菌工作臺（AIR TECH，蘇凈集團安泰公司），7080 全自動生化分析儀（日立公司，日本），Primo vert 倒置顯微鏡（蔡司，德國），SYNERGY4多功能酶標儀（BioTek 公司，美國），Odyssey雙色紅外線掃膜儀（Li-Cor 公司，美國），ABI 7900 Real-Time PCR System（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

通心絡(luò)超微粉（批號:S-130901）由石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供。將通心絡(luò)粉末溶解于0.5%羥甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液中，制備成濃度為1.5 g·（kg·天）-1的灌胃混懸液。

2.2 實驗動物模分組與給藥

45 只SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠,適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為3 組（n = 15），低脂對照組（低脂飲食，LFD+CMC），模型組（高脂飲食，HFD+CMC），通心絡(luò)組（高脂飲食+ 通心絡(luò)干預，1.5 g·（kg·天）-1，HFD +TXL），根據(jù)本實驗室前期研究選取通心絡(luò)的最優(yōu)給藥濃度為1.5 g·（kg·天）-1。在18 周給藥期間，每周稱量小鼠體質(zhì)量。

2.3 血液生化指標

小鼠喂養(yǎng)18 周后，禁食12 h,摘眼球取血，冰上靜置30 min，4℃，3000 r·min-1，離心10 min，取上清，檢測TC，TG，HDL-C，LDL-C水平。

2.4 腸系膜動脈血管環(huán)的制備

參考之前的報道[9]，用CO2吸入法處死小鼠，迅速取出腸血管組織，置于持續(xù)通氧的預冷PSS 緩沖液中，在解剖顯微鏡視野下，剝離血管周圍的脂肪組織及結(jié)締組織，選?、蠹壞c系膜動脈分支，剪取2 mm 左右血管，置于37 ℃含5 mL PSS 緩沖液的Chamber 中，用兩根鎢絲穿過血管，一根固定在張力轉(zhuǎn)換器，另一根固定在可調(diào)節(jié)負荷的裝置上，緩慢調(diào)至平衡狀態(tài)，使血管不受力，將固定有血管的Chamber 移至Interface 上，同時連接傳感器，并向浴槽內(nèi)持續(xù)通入含有95% O2和5% CO2混合氣體。穩(wěn)定15 min 后，進行調(diào)零設(shè)置。腸系膜動脈初始張力給與1.5 mN，平衡1 h后，再次進行調(diào)零設(shè)置。給與60 mmol·L-1的K-PSS 溶液刺激血管，待收縮力達到平臺期時，更換PSS緩沖液洗脫4 次，每次5 min，直至基線附近，如此循環(huán)3 次。加入5 μL 的10-3mol·L-1NE 收縮血管，當收縮值達到平臺期后加入乙酰膽堿（累加劑量10-8-10-5mol·L-1）舒張血管。舒張功能以血管舒張率表示，（Ach舒張幅度占PE 預收縮幅度的百分比）[10]。實驗結(jié)束后，收集腸系膜動脈，存放于-80℃冰箱凍存。

2.5 RT-PCR 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡相關(guān)基因mRNA表達

表1 引物設(shè)計

根據(jù)制造商的說明，提取腸系膜動脈中總RNA，使用微量核酸蛋白檢測儀（Gene 2000）測定RNA 的純度及濃度，選取A260/A280 值在1.9-2.1 范圍的樣品，按照Prime Script TM 合成試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA,按照SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說明書，在ABI 7900 H 序列檢測PCR 系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR反應。引物設(shè)計如表1。

2.6 細胞培養(yǎng)與分組

將HUVEC 細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1‰三抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，當細胞處于對數(shù)生長期則開始實驗，實驗分為3個組：正常對照組（control group）；模型組（Hcy group）；通心絡(luò)組（TXL group）。

2.7 MTS法確定Hcy給藥濃度

按照1 × 105的密度，將HUVEC 細胞接種于96 孔板中，待細胞貼壁生長至70%后，分別加入含不同濃度的Hcy 培養(yǎng)液（0.25、1、2、4、6、8、10 mM），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取上清，每孔加入100 μL 的MTS（5 mg·mL-1）,37℃孵育1 h 后，選擇490 nm、630 nm 波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，結(jié)合細胞形態(tài)觀察并確定最適造模濃度。

2.8 藥物細胞毒性檢測

當細胞密度達到70%時，將HUVEC 細胞以每孔1×105的密度接種于96 孔板中，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后。分別用無血清（control group）、40、60、80、100 、150、200、400、600、800 μg·mL-1的TXL 處理細胞。處理24 h 后每孔加入100 μL MTS（5 mg·mL-1）,37℃孵育1 h，選擇490 nm、630 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，分析TXL對HUVEC細胞的毒性。

2.9 通心絡(luò)藥效實驗

分別用無血清（control group），2 mM Hcy(Hcy group)、2 mM Hcy + 100 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy + 200 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy + 400 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy +600 μg·mL-1TXL，2 mM Hcy + 800 μg·mL-1TXL 處理細胞，確定最適給藥濃度。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化趨勢圖

2.10 Western blot

檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白表達收集細胞裂解液的蛋白樣品，采用BCA 法進行蛋白定量，將提取的蛋白進行SDS-PAGE,然后轉(zhuǎn)移到NC膜上，37℃封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，10 min/次，然后熒光二抗37℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次，通過Odyssey 成像系統(tǒng)檢測帶信號，并通過圖像分析軟件（LI-CO，USA）進行量化。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（x ±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行檢驗，方差齊性兩兩檢驗采用LSD，方差不齊用Dunnett’s T3法，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 TXL對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和血脂的影響

與LFD 組小鼠相比，高脂飼料喂養(yǎng)（HFD）組小鼠體質(zhì)量從第四周開始明顯增加，直至實驗結(jié)束，TXL組小鼠體質(zhì)量較HFD組有所減輕（圖1）。與LFD組比較，HFD 組小鼠TC、TG、LDL-C 明顯升高，而TXL 組小鼠TC、TG、LDL-C的水平顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠血脂水平比較

圖3 通心絡(luò)對Ach誘導的小鼠腸系膜動脈舒張功能的影響

4.2 TXL在Ach介導小鼠腸系膜動脈舒張中的作用

在終濃度為10-5mol·L-1的NE 誘發(fā)最大收縮后，分別累計濃度梯度Ach（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5）mol·L-1介導的舒張作用下，LFD 組腸系膜動脈血管舒張率為（86.6 ± 15.1）%，HFD 組腸系膜動脈血管舒張率為（38.36±3.0）%，TXL 組血管舒張率為（61.21±4.7）%,差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），表明TXL 可改善高脂飲食小鼠的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應（圖3）。

4.3 TXL對GRP78、凋亡通路蛋白及mRNA的表達

GRP78，又稱免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋白。與HFD 組相比，經(jīng)TXL 干預后，GRP78、PERK、CHOP、Bax mRNA 表達下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2mRNA表達顯著上調(diào)（P＜0.01）。

4.4 TXL對細胞活力的影響

圖4 通心絡(luò)對GRP78、PERK、CHOP、Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

圖5a 不同濃度Hcy對HUVEC細胞生存活性的影響

圖5b 不同濃度TXL對HUVEC細胞生存活性的影響

使用MTS 實驗研究了不同濃度的Hcy 對HUVEC細胞存活狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示，造模濃度為2 mM時，對細胞有明顯的損傷作用，隨后，觀察TXL 對HUVEC 細胞的毒性，在處理24 h 中，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性作用，且當通心絡(luò)濃度為200 μg·mL-1,TXL對Hcy 孵育的HUVEC 細胞具有明顯的保護作用（圖5a-c）。

4.5 通心絡(luò)通過抗凋亡途徑保護血管內(nèi)皮

圖5c TXL對Hcy誘導的細胞損傷的影響

與control group 比較，Hcy group 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Cleaved Caspase-3，Caspase-7，Caspase-9，表達升高（P ＜0.05）；與Hcy group 比較，TXL group Caspase-3, Cleaved Caspase-3，Caspase-7，Caspase-9蛋白表達明顯降低（P ＜0.05），表明通心絡(luò)能減少內(nèi)皮細胞凋亡。

5 討論

內(nèi)皮功能障礙是心血管事件的早期風險標志之一[11]，其特征是eNOS 活性和/或表達降低，以及一氧化氮（NO）生物利用度降低[12]。而肥胖造成的脂質(zhì)沉積則是引起內(nèi)皮功能障礙的重要原因之一。肥胖患者的血管穩(wěn)態(tài)受損是由多種因素引起的，包括缺氧、免疫失衡、氧化應激和脂肪因子分泌模式的改變，這些干擾因素獨立或協(xié)同地降低血管NO 的生物利用度，這被認為是內(nèi)皮功能障礙進展中的1 個關(guān)鍵步驟[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激加劇代謝功能障礙，從而導致血脂異常、脂肪肝和胰島素抵抗[5]。研究表明，胰高血糖素樣肽1（GLP1）激活UCP2/AMPK通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，恢復eNOS 活性，進而改善內(nèi)皮細胞功能[14]；在肺動脈高壓患者中，描述了ERs對eNOS表達的負面影響[15]。

長期的高脂飲食會引起甘油三酯和膽固醇的升高，導致高脂血癥，而高脂血可通過氧化應激、炎癥反應、OX-LDL等作用機制導致血管內(nèi)皮損傷，造成內(nèi)皮功能紊亂，增加內(nèi)皮炎癥反應。本實驗采取高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠復制肥胖模型，以期進一步探究通心絡(luò)在肥胖模型下，對血管內(nèi)皮功能的影響。實驗結(jié)果顯示，通心絡(luò)可降低血清中TC、TG、LDL-C 水平。前期研究顯示[16]，通心絡(luò)具有劑量依賴性調(diào)節(jié)血脂水平，可通過激活PI3K/AKT 信號通路的表達，上調(diào)NO的濃度，減少ET-1的表達，改善血管內(nèi)皮功能。

腸系膜動脈是形成外周阻力的主要血管，對血壓的調(diào)節(jié)有著重要意義[17]。血管內(nèi)皮細胞通過與血管壁和管腔細胞之間多個復雜的相互作用來維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[18]。血管的收縮、舒張功能失調(diào)可能會導致心腦血管疾病的發(fā)生。血管舒縮活動的異常，引起血管張力的升高，外周阻力增大，進而引起高血壓的發(fā)生。本實驗進一步研究，小鼠肥胖模型下腸系膜動脈內(nèi)皮舒張功能，提示高脂喂養(yǎng)所致脂代謝紊亂可引起內(nèi)皮性舒張功能障礙，通心絡(luò)組的血管舒張率較高脂組明顯提高，表明通心絡(luò)可改善高脂飲食動物的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應，保護血管內(nèi)皮功能。

圖6 TXL對Hcy誘導的HUVEC細胞損傷蛋白表達情況的影響

GRP78 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的標志性蛋白。檢測HUVEC 細胞中GRP78 蛋白表達明顯上調(diào)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生，而經(jīng)通心絡(luò)干預后，GRP78 表達下調(diào)。長期且嚴重的ERs通過激活CHOP、JNK、Caspase-12 3條通路誘導細胞凋亡，上調(diào)Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 的蛋白表達，通心絡(luò)干預后凋亡相關(guān)的蛋白表達較Hcy 組明顯下調(diào)。另外，通心絡(luò)能增加抗凋亡蛋白Bcl-2的基因表達，降低促凋亡蛋白Bax的基因表達。ERs 發(fā)生后，激活Caspase-12,進而激活Caspase-9、Caspase-3 等效應Caspase。N 端前域長的Caspase-8、Caspase-9 作為凋亡的啟始蛋白，位于級聯(lián)反應凋亡的最上游，N 端前域短的Caspase-3、Caspase-7 位于凋亡“瀑布”反應下游，Caspase-3 在促凋亡信號的最后一步被激活，而抑制Caspase 活性則能減弱細胞的損傷和凋亡[19]。Caspase-3 是死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑三者共同的效應分子。

通心絡(luò)以絡(luò)病學說為指導，益氣活血、搜風通絡(luò)為原則而創(chuàng)立。由人參、蜈蚣、全蝎、水蛭、土鱉蟲、赤芍、酸棗仁、降香等藥物組成。方中人參益氣通絡(luò)，蜈蚣、土鱉蟲通絡(luò)剔瘀，全蝎、蟬蛻搜風解痙，赤芍涼血化瘀，酸棗仁養(yǎng)血安神，配伍芳香之檀香、降香、乳香、冰片入絡(luò)通竅[8]。有研究表明，通心絡(luò)通過激活PI3K/Akt通路，來實現(xiàn)抗ERs所致凋亡作用[20]。大量實驗和臨床證據(jù)表明[16,21,22]，通心絡(luò)可降低NO 水平，改善血管內(nèi)皮功能、氧化應激指標和減輕微炎癥狀態(tài)等多重作用。最新研究顯示[23]，通心絡(luò)膠囊可延緩頸動脈平均內(nèi)中膜厚度、斑塊面積和血管重構(gòu)指數(shù)的進展。通心絡(luò)的獨特理論特色和確切臨床效果引起了國內(nèi)中西醫(yī)學界的關(guān)注，其可改善血管內(nèi)皮功能這一血管病始動因素，并可有效阻斷血管病變的不同病理環(huán)節(jié)，體現(xiàn)了通絡(luò)中藥標本兼治、防治結(jié)合的作用特點。但針對肥胖導致的血管損傷并未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)能改善細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，有效預防高脂膳食導致的血管內(nèi)皮功能損害。