張靜驛，高 耀，陳建麗，秦雪梅，田俊生＊＊，武嫣斐

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 太原 030001；2. 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 太原 030001；3. 山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心 太原 030006）

抑郁癥是一種以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的一類心境障礙[1]。其具有疾病發(fā)病率、疾病復(fù)發(fā)率、疾病致殘率高“三高”的特點(diǎn)[2]。抑郁癥不僅影響患者的生活質(zhì)量，還能給患者及家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，研發(fā)有效且不良反應(yīng)小的抗抑郁癥藥物對(duì)于抑郁癥的治療有重要的意義。

PC12 細(xì)胞是一種具有神經(jīng)內(nèi)分泌作用的腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞，常用于抑郁癥等疾病的研究[4]。CORT 是HPA 軸末端的重要激素，其異常增加可以導(dǎo)致抑郁特征[5]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分抑郁癥患者體內(nèi)的HPA 軸異常激活，從而引起細(xì)胞的損傷或凋亡[6]。課題組前期采用代謝組學(xué)方法研究確認(rèn)了CORT誘導(dǎo)低分化PC12 細(xì)胞可以作為最適的抑郁癥體外研究模型[7]。本實(shí)驗(yàn)小組按照新藥技術(shù)路線，將復(fù)方柴歸方（FFCGF）研發(fā)成的抗抑郁中藥新藥“柴歸顆?！币呀?jīng)獲得國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)批件（2018L03149）[8.9]。

課題組前期采用行為絕望模型、慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激模型、利血平拮抗模型、5-HT 誘導(dǎo)甩頭模型等抑郁癥動(dòng)物模型反復(fù)多次對(duì)FFCGF 的抗抑郁藥效進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間，CUMS 模型引起的大鼠體重下降、快感缺乏、活動(dòng)力降低，利血平拮抗致小鼠眼瞼下垂、體溫下降、運(yùn)動(dòng)不能，5-HT 誘導(dǎo)甩頭等主要藥效指標(biāo)均具有明顯的改善[9-11]，但FFCGF在細(xì)胞水平的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。

本研究擬采用CORT 誘導(dǎo)低分化PC12 抑郁細(xì)胞模型，通過測(cè)定乳酸脫氫酶釋放率、細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量等指標(biāo)，探討FFCGF 細(xì)胞保護(hù)和抗凋亡作用，觀察其對(duì)PC12 細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為柴歸顆粒治療抑郁癥作用機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 藥品

FFCGF 中藥材均購自山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢測(cè)符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。

1.3 試劑

胰蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司，MTT、DMSO：美國(guó)西格瑪奧德里奇有限公司，RPMI 1640 培養(yǎng)液、血清：Hyclone，Logan，USA，乳酸脫氫酶試劑盒：北京索萊寶科技有限公司，CORT：中國(guó)成都化夏化學(xué)試劑有限公司，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）、Fluo-3 Am 鈣離子熒光探針：碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱，低速離心機(jī)，TGL-16 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，SynergyMx 多功能酶標(biāo)儀，BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀。

2 方法

2.1 FFCGF提取物的制備及質(zhì)量控制

按照處方比例組成，參考已有制備工藝及質(zhì)量控制方法，獲得FFCGF 提取物，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制（每g 提取物中含芍藥苷8.9 mg，柴胡皂苷a 2.5 mg）[8]。

2.2 細(xì)胞分組、造模及給藥

低分化PC12 細(xì)胞生長(zhǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h 后，分為6 組，分別是空白組，模型組（500 μM CORT 損傷），F(xiàn)FCGF 低劑量組（50 mg·L-1），F(xiàn)FCGF 中劑量組（100 mg·L-1），F(xiàn)FCGF高劑量組（200 mg·L-1），F(xiàn)FCGF 極高劑量組（400 mg·L-1），逍遙散（XYS）組（200 mg·L-1）、給藥時(shí)間為36 h。

2.3 細(xì)胞活力的測(cè)定

給藥36 h 之后，首先移除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100 μL，等待4 h 之后，去掉培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，混合均勻，最后采用MTT 法于490 nm下測(cè)定吸光度值。

2.4 乳酸脫氫酶的測(cè)定

給藥36 h 之后，將培養(yǎng)液通過1000 rpm 離心機(jī)離心5 min，取離心管中的上清液，按照乳酸脫氫酶試劑盒說明書測(cè)定乳酸脫氫酶測(cè)定。

2.5 細(xì)胞凋亡測(cè)定

給藥36 h 之后，胰酶消化后收集細(xì)胞，刺激結(jié)束后，用胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS 洗滌2次，1000 rpm 離心機(jī)離心5 min，然后丟掉上清液，重新加入PBS，通過敲打和過濾的方法制備成細(xì)胞懸浮液體，最后加入Annexin V-FITC/PI 雙染色劑，孵育時(shí)間為20 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.6 線粒體膜電位測(cè)定

給藥36 h 之后，胰酶消化后收集細(xì)胞，用PBS 洗滌2 次，1000 rpm 離心機(jī)離心5 min，然后丟掉上清液，重新加入PBS，通過敲打和過濾的方法制備成細(xì)胞懸浮液體，加入JC-1 染色工作液，孵育時(shí)間為20 min，1000 rpm 離心機(jī)離心5 min，收集細(xì)胞，加入JC-1 染色緩沖液，上機(jī)檢測(cè)。

2.7 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的測(cè)定

給藥36 h 之后，胰酶消化后收集細(xì)胞，用DHanks 緩沖液洗滌1 次，沉淀細(xì)胞，加入Fluo-3 Am 探針37℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，加入D-Hanks 緩沖液洗滌，沉淀細(xì)胞后，于37℃孵育30 min 后，上機(jī)檢測(cè)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±S.D.形式表示，使用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，P ＜0.05 表示具有顯著性差異，P ＜0.01 表示具有極顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 FFCGF 對(duì)CORT 誘導(dǎo)的低分化PC12 細(xì)胞活力的影響

FFCGF 對(duì)CORT 致低分化PC12 損傷細(xì)胞活力的影響如圖1 所示。模型組的細(xì)胞活力與空白組比較，細(xì)胞活力值極顯著降低。FFCGF 各給藥組（100-400 mg·L-1）與模型組比較，細(xì)胞活力值均明顯升高。結(jié)果顯示FFCGF 在100 mg·L-1出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且之后隨著濃度的升高其吸光度值增加幅度不大，因此后續(xù)研究中乳酸脫氫酶的測(cè)定、細(xì)胞凋亡測(cè)定、線粒體膜電位測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的測(cè)定均采用100 mg·L-1作為該藥物的中劑量組。研究結(jié)果同樣也表明FFCGF 給予CORT 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞，未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖1 FFCGF對(duì)CORT致低分化PC12損傷細(xì)胞活力的影響

圖2 FFCGF對(duì)CORT致低分化PC12損傷細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放率的影響

圖3 不同組Annexin V-FITC/PI雙染測(cè)凋亡流式散點(diǎn)圖

3.2 FFCGF 對(duì)CORT 誘導(dǎo)的低分化PC12 細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放率的影響

FFCGF 對(duì)CORT 致低分化PC12 損傷細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放率的影響如圖2所示。模型組的細(xì)胞活力與空白組比較，乳酸脫氫酶釋放率極顯著增加。FFCGF與模型組比較，乳酸脫氫酶釋放率明顯降低，并且不同濃度的FFCGF 之間無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導(dǎo)低分化PC12 細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放率發(fā)揮保護(hù)作用。

3.3 FFCGF 對(duì)CORT 誘導(dǎo)低分化PC12 細(xì)胞凋亡率的影響

不同組Annexin V-FITC/PI 雙染測(cè)凋亡流式散點(diǎn)圖如圖3所示。散點(diǎn)圖左上角、右上角、右下角和左下角分別表示死亡、晚凋、早凋和正常狀態(tài)的細(xì)胞。通過散點(diǎn)圖我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細(xì)胞凋亡率與空白組比較，早凋、晚凋和死細(xì)胞增加。FFCGF 與模型組比較，早凋、晚凋和死細(xì)胞明顯降低。

圖4 FFCGF對(duì)CORT致低分化PC12損傷細(xì)胞凋亡率的影響

通過計(jì)算不同象限細(xì)胞數(shù)多少表示細(xì)胞的凋亡率結(jié)果如圖4所示。通過凋亡率結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)模型組的細(xì)胞活力與空白組比較，細(xì)胞的凋亡率增加。FFCGF 與模型組比較，細(xì)胞的凋亡率明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導(dǎo)低分化PC12細(xì)胞凋亡率發(fā)揮保護(hù)作用。

3.4 FFCGF 對(duì)CORT 誘導(dǎo)低分化PC12 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

不同組線粒體膜電位流式散點(diǎn)圖如圖5所示。通過散點(diǎn)圖我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細(xì)胞線粒體膜電位與空白組比較，線粒體膜電位極顯著降低。FFCGF 與模型組比較，線粒體膜電位都有顯著的升高。

通過計(jì)算線粒體膜電位的細(xì)胞比例結(jié)果如圖6所示。通過凋亡率結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細(xì)胞活力與空白組比較，線粒體膜電位降低的細(xì)胞數(shù)目。FFCGF 與模型組比較，線粒體膜電位降低的細(xì)胞顯著減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導(dǎo)低分化PC12細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

3.5 FFCGF 對(duì)CORT 誘導(dǎo)的低分化PC12 細(xì)胞鈣離子的影響

不同組鈣離子細(xì)胞流式圖如圖7所示。通過細(xì)胞流式圖我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的鈣離子與空白組比較，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度較大。FFCGF 與模型組比較，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度減少。通過定量計(jì)算峰面積如圖8所示。通過凋亡率結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)模型組的細(xì)胞活力與空白組比較，熒光強(qiáng)度增至40%左右。FFCGF 與模型組比較，各給藥組熒光強(qiáng)度均顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FFCGF 可通過降低CORT 誘導(dǎo)低分化PC12細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度發(fā)揮保護(hù)作用。

圖5 不同組JC-1探針染色測(cè)線粒體膜電位流式散點(diǎn)圖

圖6 FFCGF對(duì)CORT致低分化PC12損傷線粒體膜電位的影響

4 討論

不同的細(xì)胞指標(biāo)都可以用于評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷和凋亡的程度。本研究采用不同的指標(biāo)對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)低分化PC12 抑郁細(xì)胞模型的損傷程度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。FFCGF 對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的低分化PC12 抑郁細(xì)胞模型的保護(hù)作用也可以用這些指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。細(xì)胞活力是體外細(xì)胞培養(yǎng)和研究中的一個(gè)重要結(jié)果[12]。細(xì)胞活力可用于評(píng)價(jià)模型復(fù)制是否成功，同時(shí)可以用于評(píng)價(jià)藥物的效應(yīng)。這些指標(biāo)均可為新藥研究提供重要技術(shù)支撐。乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，以氧化型輔酶Ⅰ（MADI）為氫受體，在細(xì)胞內(nèi)催化L-乳酸與丙酮酸之間可逆反應(yīng)的一種脫氫酶。當(dāng)細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞胞間的乳酸脫氫酶活性升高[13]，所以乳酸脫氫酶活性可以用來評(píng)價(jià)細(xì)胞的損傷和凋亡程度。

細(xì)胞凋亡是指為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡[14]。細(xì)胞凋亡早期的特征之一是磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使磷脂酰絲氨酸暴露在細(xì)胞膜外表面。而人膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV）對(duì)磷脂酰絲氨酸具有特異的親和作用，將Annexin V 進(jìn)行熒光素——FITC 標(biāo)記，作為一敏感的探針可檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸，利用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，從而可以用于研究FFCGF對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件[15，16]。JC-1是一種理想的用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，可以檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。同時(shí)，鈣離子是機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)不可缺少的離子。它對(duì)于維持細(xì)胞膜兩側(cè)的生物電位，維持正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能。鈣離子的水平的變化影響很多生命活動(dòng)的變化，例如神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細(xì)胞間的信息傳遞和神經(jīng)元的存活，因此可以依據(jù)鈣離子水平的變化判斷細(xì)胞的存活狀態(tài)[17，18]。

圖7 不同組Fluo-3 Am染色測(cè)鈣離子細(xì)胞流式圖

圖8 FFCGF對(duì)CORT致低分化PC12損傷細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響

本課題研究中采用基于抑郁癥中HPA 軸活化的理論建立的細(xì)胞模型，即高濃度CORT進(jìn)行刺激，并采用PC12 細(xì)胞作為應(yīng)激對(duì)象。HPA 軸亢進(jìn)假說是建立抑郁癥體外模型最常用的理論之一，CORT 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于抗抑郁藥物的藥效及機(jī)制研究。神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)之一是神經(jīng)細(xì)胞凋亡。鈣離子內(nèi)流和線粒體膜電位丟失是評(píng)價(jià)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的具體指標(biāo)。鈣離子信號(hào)通路在神經(jīng)元系統(tǒng)的發(fā)育中具有至關(guān)重要的作用。在神經(jīng)元中鈣離子可調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、細(xì)胞間的信息傳遞和神經(jīng)元的存活，因此測(cè)定神經(jīng)元中鈣離子水平的變化是對(duì)細(xì)胞存活狀態(tài)觀察的一個(gè)重要指標(biāo)。同樣，線粒體膜電位丟失是細(xì)胞早期凋亡的重要特征。線粒體膜電位的降低導(dǎo)致細(xì)胞色素C等釋放，活化Caspase蛋白酶家族，引起細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過檢測(cè)線粒體膜電位能夠判斷細(xì)胞是否進(jìn)入不可逆的過程。本文采用流式細(xì)胞儀利用JC-1 探針對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，從另一個(gè)重要方面對(duì)藥物的保護(hù)作用進(jìn)行研究。因此，抗抑郁藥物對(duì)膜電位和鈣離子濃度變化的影響，對(duì)細(xì)胞起到很好的保護(hù)作用，抑制細(xì)胞凋亡，從而可以評(píng)價(jià)藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷后，細(xì)胞活力指標(biāo)下降，而乳酸脫氫酶釋放率、細(xì)胞凋亡率及鈣離子濃度指標(biāo)升高，與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致[19-21]。給予FFCGF 后對(duì)應(yīng)的指標(biāo)發(fā)生回調(diào)，表明FFCGF 對(duì)CORT 誘導(dǎo)低分化PC12 細(xì)胞損傷具有較好的保護(hù)作用。該研究結(jié)果為復(fù)方柴歸方抗抑郁藥物的成藥性評(píng)價(jià)提供了充分科學(xué)依據(jù)。