林遠茂，施榮聰，黃寶特，徐世安，孫玉信，姜 楓

（1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南寧 530011；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530011；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 鄭州 450003）

高脂血癥（Hyperlipidemia）是人體脂質(zhì)代謝的異常的一種表現(xiàn)，其特征在于總膽固醇、甘油三酸酯和低密度脂蛋白膽固醇的升高，或伴隨著高密度脂蛋白膽固醇的循環(huán)水平降低[1]。高脂血癥相關(guān)的脂質(zhì)疾病被認(rèn)為是動脈粥樣硬化性心血管疾病的主要原因，高脂血癥已被列為導(dǎo)致冠心病患病率和嚴(yán)重性的最大危險因素之一[2]。隨著生活習(xí)慣的改變和膳食營養(yǎng)的提高，人體攝入高脂肪和高糖分含量的食物越來越多，高脂血癥患者數(shù)量逐年上升，高脂血癥已經(jīng)成為危害全球健康的危險因素[3]。目前，國內(nèi)外對中草藥降低血漿膽固醇水平的作用做了充分研究，證實中草藥在降低膽固醇水平方面的有效性和安全性[4]。古代中醫(yī)書籍中，可見“膏粱”“高脂”等關(guān)于現(xiàn)代高脂血癥的相關(guān)記載；中醫(yī)認(rèn)為，高脂血癥常伴有“血瘀”“痰濁”“濕阻”等特征，在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，中醫(yī)藥在臨床上已廣泛應(yīng)用于高脂血癥及其相關(guān)并發(fā)癥的治療，具有療效明顯、毒副作用小的優(yōu)點[5]。

運脾湯是國醫(yī)大師張磊教授“臨證八法”中“運通法”的代表方，在“腑以通為順”“脾以運為健”的基本思想上立法組方，其主要藥物組成有檳榔、炒牽牛子、豆蔻、茯苓、炒麥芽、炒神曲、炒山楂等藥物，具有運脾化積，消食導(dǎo)滯等功效，臨床多用于治療飲食失節(jié)、脾濕過盛，運化失常所致的諸多病癥[6]。本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等數(shù)據(jù)挖掘和分析的方法，探討“中藥有效成分-靶點-疾病”之間的復(fù)雜作用關(guān)系，從而挖掘國醫(yī)大師張磊運用運脾湯治療高脂血癥的現(xiàn)代藥理作用機制，為運脾湯治療高脂血癥的進一步探討提供參考。

1 資料與方法

1.1 運脾湯有效化學(xué)成分的收集和篩選及靶點預(yù)測

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），將同時滿足口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的化合物作為納入標(biāo)準(zhǔn)[7]，得到山楂、麥芽、萊菔子、陳皮、半夏、茯苓、連翹、檳榔、牽牛子、甘草的潛在活性化合物成分及相關(guān)靶點；查閱相關(guān)文獻對神曲的潛在活性成分進行補充。Pharm Mapper 數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），對已篩選出的部分潛在有效化學(xué)成分進行靶點預(yù)測補充，在數(shù)據(jù)庫中不能預(yù)測到作用靶點的成分則剔除。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）篩選人源靶點并進行基因注釋。

1.2 高脂血癥疾病靶點的收集

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org/）這兩個數(shù)據(jù)庫中，以“Hyperlipidemia”為檢索詞檢索，綜合獲取的數(shù)據(jù)，去除重復(fù)值，取并集，得到高脂血癥疾病的相關(guān)疾病基因。

1.3 預(yù)測運脾湯治療高脂血癥的相關(guān)靶點

運用Venny 平臺（2.1，http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將運脾湯中有效化學(xué)成分所對應(yīng)的相關(guān)靶點與高脂血癥的疾病靶點取交集，得到運脾湯治療高脂血癥的相關(guān)靶點。

1.4 運脾湯治療高脂血癥相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖與分析

將運脾湯的靶點基因和高脂血癥疾病基因取的交集，導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建其蛋白互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，分析運脾湯治療高脂血癥相關(guān)靶點之間的相互作用關(guān)系。使用Cytoscape（3.6.0）軟件進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化處理，并通過Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)。

1.5 化合物與靶點分子對接

iGEMDOCK 是通用進化方法用于計算相對于靶蛋白活性位點的配體構(gòu)象和方向的軟件?？梢杂糜诔醪胶Y選和精度對接。其結(jié)果以能量的高低去判斷靶蛋白與配體的結(jié)合程度，通常靶蛋白與化合物配體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時的能量越低，說明發(fā)生作用的可能性越大。根據(jù)1.4 中通過計算拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)得到的degree值排名前10類的靶蛋白，在PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）檢索，并保持其pdb 格式文件。根據(jù)1.4中度值（degree）≥5 的化合物在TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取其化合物配體mol2格式文件。

1.6 生物信息學(xué)分析

運用DAVID 生物信息學(xué)資源平臺6.8（https://david.ncifcrf.gov/）做交集基因的GO 富集分析與KEGG富集分析。限定研究物種為人類，選擇Gene Ontology下的分子功能（Molecular Function）、生物過程（Biological Process）和細胞組成（Cellular Component）3個部分進行GO 富集分析，選擇Pathway 分析中KEGG Pathway，設(shè)定顯著性為P＜0.05，進一步尋找活性成分作用靶點顯著富集的主要功能注釋與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.7 構(gòu)建“中藥材-有效化學(xué)成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)

將所有分析結(jié)果整理并導(dǎo)入Cytoscape（3.6.0）軟件，處理得到“中藥材-有效化學(xué)成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 運脾湯有效化合物和相關(guān)靶點

在運脾湯中，去除雞內(nèi)金和鱉甲兩味未檢索到對應(yīng)化合物信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到山楂有6 種有效化合物及其對應(yīng)的人源靶點144 個、麥芽18 種對應(yīng)56 個、萊菔子3種對應(yīng)4個、陳皮5種對應(yīng)41個、半夏13種對應(yīng)73 個、茯苓15 種對應(yīng)15 個、連翹23 種對應(yīng)219 個、檳榔8 種對應(yīng)13 個、牽牛子22 種對應(yīng)111 個、甘草92種對應(yīng)720 個，神曲8 種對應(yīng)146 個，去除重復(fù)化合物及重復(fù)靶點，運脾湯共計128 種有效成分對應(yīng)人源靶點142個。

2.2 高脂血癥疾病靶點數(shù)據(jù)庫

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中，初步篩選獲得1164 個與高脂血癥相關(guān)的候選基因，根據(jù)“Relevance score”度值，選取相關(guān)度較高的前600 個結(jié)果，在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫中檢索，發(fā)現(xiàn)231 個相關(guān)基因，經(jīng)合并數(shù)據(jù)庫查詢，去除重復(fù)共篩選出718 個與高脂血癥高度相關(guān)性靶點。

2.3 運脾湯治療高脂血癥的相關(guān)靶點和活性化學(xué)成分

通過Venny平臺分析得到運脾湯中干預(yù)高脂血癥的靶點40 個（圖1），其中共涉及128 個有效化學(xué)成分（表1）。在運脾湯所有有效化學(xué)成分中，與關(guān)鍵靶點關(guān)系密切的前10的有效化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)（圖2）。

表1 運脾湯有效化學(xué)成分詳細信息

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 運脾湯作用靶點與高脂血癥靶點韋恩圖

2.4 運脾湯治療高脂血癥相關(guān)靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖與分析

將運脾湯干預(yù)高脂血癥的40個靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)相互作用分析，設(shè)置可信度為0.4，得到靶點之間相互作用關(guān)系。導(dǎo)入Cytoscape（3.6.0）軟件進行可視化（圖3）。在Cytoscape（3.6.0）軟件中，通過Network Analyzer 功能分析網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)degree結(jié)果顯示，胰島素（INS）、白介素6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、過氧化物酶體增殖物激活的受體γ（PPARG）、一氧化氮合酶（NOS3）、表皮生長因子受體（EGFR）、載脂蛋白B（APOB）、細胞間粘附分子1（ICAM1）、CAV1和雌激素受體（ESR1）為運脾湯干預(yù)高脂血癥的核心靶點；且運脾湯中干預(yù)高脂血癥的活 性 化 學(xué) 成 分naringenin、quercetin、kaempferol 和luteolin主要來源于連翹、山楂、神曲、陳皮、甘草。

表2 運脾湯干預(yù)高脂血癥蛋白互作拓?fù)鋵W(xué)分析（按度值排序取前10個）

2.5 分子對接結(jié)果

iGEMDOCK 分子對接結(jié)果將運脾湯干預(yù)高脂血癥的10 個關(guān)鍵靶點與運脾湯中經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計算的22個關(guān)鍵化合物進行分子對接，靶蛋白與化合物配體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低發(fā)生的作用可能性越大[8]，分析結(jié)合力具體參數(shù)（圖4）和具體分子對接參數(shù)（表3），其中結(jié)合性最強的是NOS3與nobiletin（圖5）。

2.6 運脾湯主要活性成分對高脂血癥作用靶點的生物信息學(xué)分析結(jié)果

圖2 網(wǎng)絡(luò)中度值排名前10的有效化學(xué)成分結(jié)構(gòu)

圖3 運脾湯干預(yù)高脂血癥相關(guān)靶點間蛋白互作關(guān)系

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能富集分析，結(jié)果得到48 個GO 功能富集條目，其中涉及生物過程（BP）的相關(guān)條目最多，共計30 條，主要包括一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、細胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、上皮細胞增殖的正調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、蛋白激酶B 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控和凋亡過程的負(fù)調(diào)控等方面；其中有7 條細胞組成（CC），主要包括膜筏、受體復(fù)合體、基底外側(cè)質(zhì)膜、質(zhì)膜的外側(cè)和內(nèi)體膜等方面；并有11 條分子功能（MF），主要包括類固醇激素受體活性、酶結(jié)合和蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性等方面（圖6）。

KEGG 通路富集分析得到48 條信號通路，其中按Gene Ratio 值選取25 條富集結(jié)果最相關(guān)的信號通路，導(dǎo)入RSudio 軟件制作高級氣泡圖進行分析（圖7、表3）。包括HIF-1 信號通路、胰島素信號通路、PI3KAkt 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、Fox O信號通路、TNF信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化和卵巢類固醇生成等通路。分析靶點與相關(guān)性較大的通路HIF-1 信號通路的作用關(guān)系（圖8），紅色為表達促進作用。

2.7 構(gòu)建“中藥材-有效化學(xué)成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)

圖4 運脾湯主要化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果

圖5 NOS3與nobiletin

根據(jù)上述結(jié)果，繪制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析運脾湯干預(yù)高脂血癥的各元素綜合網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)degree 調(diào)節(jié)節(jié)點大小，使核心靶點和主要有效化學(xué)成分在網(wǎng)絡(luò)圖中突出表現(xiàn)（圖9）。網(wǎng)絡(luò)圖中共包括249 個節(jié)點、680 條邊；圖中左側(cè)的模塊分別為運脾湯各組成中藥及其主要化學(xué)成分，其中紅色六邊形節(jié)點為中藥，藍色菱形為其化學(xué)成分；右側(cè)的模塊為綠色圓形為40個關(guān)鍵靶點，最右側(cè)外方的紫色三角形模塊為KEGG 分析排名前10的信號通路。

3 討論

高脂血癥是由血脂代謝異常引起的較為常見的代謝性疾病，亦是目前公認(rèn)的動脈粥樣硬化性心血管疾病的高危誘導(dǎo)因素。生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，越來越多的人存在血脂異常癥狀。長期高水平的血脂容易誘冠心病、胰腺炎和高血壓等疾病。傳統(tǒng)的活血化瘀型中藥針對伴有“血瘀”“痰濁”“濕阻”等特征的高脂血癥，具有“活血化瘀、滋陰化濁”的顯著優(yōu)勢。國醫(yī)大師張磊教授以運脾“湯運脾化積，消食導(dǎo)滯”治療臨床上諸多脾胃運化失司導(dǎo)致的病癥，亦見于高脂血癥的治療，體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)異病同治的辨證論治思想。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步挖掘、分析運脾湯治療高脂血癥的可能作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究通過系統(tǒng)藥理學(xué)的方法分析了運脾湯中11 味中草藥的有效化學(xué)成分，及各化學(xué)成分與靶點的關(guān)系，128 個有效化學(xué)成分主要是木脂素和黃酮等幾類化學(xué)物質(zhì)。大部分化合物與關(guān)鍵靶點之間的相互作用經(jīng)過分子對接驗證，都具有較強的結(jié)合能力。通過對化合物與靶點的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）和川陳皮素（nobiletin）在網(wǎng)絡(luò)中有較高的度值和中心性，說明這些化合物在網(wǎng)絡(luò)中具有較重要的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，木犀草素可以通過與NPC1L1 結(jié)合直接抑制NPC1L1 的表達，發(fā)揮降低血液膽固醇的作用；并且抑制促炎性細胞因子TNF-α、IL-6的分泌，通過作用于TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)。木犀草素通過減少降低巨噬細胞中AMPKSIRT1信號傳導(dǎo)的機制抑制LDL 受體缺陷小鼠的動脈粥樣硬化[11]。槲皮素單獨使用或作為鐵絡(luò)合物使用，可以防止脂肪堆積，并降低血糖、血脂，減輕肝脂肪變性和氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。山奈酚可以通過多種機制抑制蛋白激酶B（AKT）和SREBP-1 的活性，并對激活PPAR α 和PPAR δ，同時促進與脂肪酸氧化和肝細胞攝取脂肪有關(guān)基因的表達，從而降低血液中甘油三酯的水平[13]。柚皮素和川陳皮素屬于柑桔類黃酮，柚皮素通過誘導(dǎo)肝脂肪酸（FA）的氧化和減弱FA 的合成，預(yù)防肝組織脂肪樣變性、肝臟中極低密度脂蛋白（VLDL）的生成和高脂血癥的形成，并減輕胰島素抵抗、緩解脂肪組織擴張和炎癥[14]。

表3 運脾湯作用高脂血癥靶點的部分富集通路

圖6 運脾湯對高脂血癥作用靶點的GO功能富集分析柱狀圖

在靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析參數(shù)顯示，INS、IL6、VEGFA、PPARG、NOS3、EGFR、APOB 和ESR1 等靶點在網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)較高的連通特性，其在運脾湯治療高脂血癥的過程可能發(fā)揮較重要作用。分子對接結(jié)果顯示，木犀草素、槲皮素、山奈酚、柚皮素、川陳皮素與NOS3、PPARG、APOB、ESR1、VEGFA 均有較強的結(jié)合活性，因此運脾湯可能是通過作用這些靶點對高脂血癥發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，VEGFA 具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡并調(diào)節(jié)血管通透性的作用[15]，NOS3 可以產(chǎn)生一氧化氮（NO），其通過cGMP 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與使血管平滑肌松弛，并介導(dǎo)冠狀血管中VEGF 的血管生成[16]。PPARG是PPARs家族中最具脂肪細胞專一性的因子，是脂肪細胞分化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者[17]，可以通過結(jié)合過降血脂藥和脂肪酸的核受體，調(diào)控過氧化物酶體脂肪酸β 的氧化途徑，促進滋養(yǎng)細胞中中性脂質(zhì)的積累以及游離脂肪酸的攝取，也增加了脂肪分化相關(guān)蛋白與脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白的合成[18]。ESR1 在調(diào)節(jié)脂肪組織中的VEGFA 介導(dǎo)的血管生成具有重要作用[19]，可抑制血管平滑肌增殖和遷移，保護血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能，預(yù)防動脈脂質(zhì)和復(fù)合糖類的形成[20]。

圖7 運脾湯對高脂血癥作用靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

圖8 運脾湯中HIF-1信號通路潛在靶基因的KEGG通路分析

圖9 運脾湯干預(yù)高脂血癥“中藥材-有效化學(xué)成分-靶點-通路”綜合網(wǎng)絡(luò)圖

運脾湯治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點GO 功能富集顯示，運脾湯可能通過藥物反應(yīng)、細胞內(nèi)外刺激、脂多糖反應(yīng)和反向調(diào)節(jié)凋亡等生物學(xué)過程來干預(yù)高脂血癥；這些靶點主要位于膜筏、基底外側(cè)質(zhì)膜、頂體膜、細胞表面等處；具有抗氧化活性和酶結(jié)合等分子功能。KEGG 結(jié)果分析，運脾湯干預(yù)高脂血癥的主要通過有HIF-1 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、胰島素信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路。HIF-1信號通路中的低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1），是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細胞在低氧環(huán)境下的反應(yīng)，在過氧化物酶體脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[21]，HIF-1 通過激活肝組織中脂素lipin 1 的表達，從而導(dǎo)致活性氧的減少和防止肝脂質(zhì)沉積[22]。AGE-RAGE 信號通路的激活能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB、VCAM-1 和炎性因子的產(chǎn)生，誘導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。是眾多糖脂代謝疾病如糖尿病、高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化等高度相關(guān)的靶點信號通路[24]。胰島素信號通路主要調(diào)節(jié)脂肪細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪分解，與胰島素抵抗密切相關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn)[26]，高脂血癥在誘發(fā)動脈粥樣硬化的過程中，炎癥細胞因子，如VEGF 和TNF-α 會誘發(fā)血管血栓的形成，同時導(dǎo)致大量正常的細胞凋亡，加劇病情的發(fā)展。

綜上所述，運脾湯中的多個有效化學(xué)成分能同時作用于2 個以上的靶點，并對應(yīng)多條信號通路，在抗炎、氧化和誘導(dǎo)細胞凋亡等方面具有一定效果，體現(xiàn)了運脾湯從多靶點、多途徑干預(yù)高脂血癥的分子機制，主要作用為改善細胞代謝、調(diào)節(jié)血管活性和糖脂代謝等多個方面。并且對冠心病等心血管及糖尿病、胰島素拮抗等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病有著多重協(xié)同效應(yīng)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科，本著整體性和動態(tài)性的特點，倡導(dǎo)多靶點、多途徑的研究分析的思路與中醫(yī)治療的整體觀念、辨證論治指導(dǎo)思想相符，也是目前研究中藥作用機制較為全面的方法[27]。本研究預(yù)測了運脾湯干預(yù)高脂血癥的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制并挖掘潛在的作用靶點，為下一步深入實驗驗證奠定了理論基礎(chǔ)和方向。