霍 嬌，朱雪嬌，曾 珠，劉運(yùn)杰，陳錦瑤*，張立實(shí)*

(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川省食品安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

早在20世紀(jì)70～80年代，北美、日本和歐洲就開(kāi)始使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性試驗(yàn)組合來(lái)評(píng)價(jià)外源化學(xué)物的遺傳毒性從而對(duì)其進(jìn)行管理[1-2]。標(biāo)準(zhǔn)遺傳毒性試驗(yàn)通常包括一項(xiàng)體外基因突變?cè)囼?yàn)、一項(xiàng)體外染色體損傷試驗(yàn)和一項(xiàng)體內(nèi)染色體損傷試驗(yàn)。管理毒理學(xué)通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的結(jié)果，將物質(zhì)分為兩種，即“具有遺傳毒性”和“不具有遺傳毒性”，并且這一評(píng)價(jià)模式也持續(xù)應(yīng)用至今[3-5]。此種定性評(píng)價(jià)物質(zhì)遺傳毒性的理論基礎(chǔ)主要為“一次打擊”(one-hit)模型，也就是只要存在一個(gè)具有遺傳毒性的外源化學(xué)物分子與DNA 發(fā)生交互作用，即可導(dǎo)致DNA損傷，從而引起突變，乃至腫瘤的發(fā)生?；凇耙淮未驌簟蹦Ｐ屠碚?，化學(xué)物的遺傳毒性劑量-反應(yīng)關(guān)系是一條直線，不存在類(lèi)似于一般毒性劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線中的“閾值”。

近年來(lái)，隨著高通量試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究表明化學(xué)物在低劑量下的劑量-反應(yīng)關(guān)系也應(yīng)為曲線。最初發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)這一劑量-反應(yīng)關(guān)系的一類(lèi)物質(zhì)是非整倍體誘導(dǎo)劑(如秋水仙素)[6]，而后研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)基因突變的物質(zhì)(如甲基磺酸乙酯、甲基磺酸甲酯和N-乙基-N亞硝基脲等)也具有類(lèi)似的低劑量曲線效應(yīng)[7-9]。關(guān)于遺傳毒性非直線劑效關(guān)系的證實(shí)促進(jìn)了一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)和研究理論的迅速發(fā)展，并為遺傳毒性定量評(píng)估提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。遺傳毒性低劑量的非直線效應(yīng)提示遺傳毒性物質(zhì)也可能存在一個(gè)不導(dǎo)致遺傳毒性產(chǎn)生的閾值，并可將其視為一個(gè)更為實(shí)際的指導(dǎo)值(與致癌性不一樣的保護(hù)性指標(biāo))，用于物質(zhì)的安全性評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

2013 年，國(guó)際遺傳毒性試驗(yàn)工作組(International Workshop on Genotoxicity Testing，IWGT)和國(guó)際生命科學(xué)學(xué)會(huì)健康與環(huán)境科學(xué)研究所(Health and Environmental Science Institute of the International Life Science Institute，ILSI-HESI)均成立了專(zhuān)門(mén)的工作組對(duì)定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的系列問(wèn)題進(jìn)行了討論，并擬定將持續(xù)關(guān)注這一問(wèn)題[10-11]。2007 年羅氏公司藥品奈非那韋(viracept)的甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)污染事件，也成功將定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法應(yīng)用于人體實(shí)際暴露后的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[12-13]。本文將針對(duì)定量遺傳毒性的分子理論基礎(chǔ)、定量評(píng)估方法、其在管理毒理學(xué)中的意義等內(nèi)容進(jìn)行介紹和總結(jié)。

1 定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估對(duì)試驗(yàn)方案/方法的要求

定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵在于確定外源化學(xué)物的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線，從而獲得可作為起始點(diǎn)(point of departure，PoD)使用的遺傳毒性閾值。PoD 是風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估特征描述中的一個(gè)重要數(shù)值，作為外推參考劑量或是安全范圍的參考點(diǎn)[10]。獲得可靠PoD 數(shù)值需要較傳統(tǒng)遺傳毒性試驗(yàn)更高通量、高涵蓋面、高準(zhǔn)確度的試驗(yàn)，例如使用流式細(xì)胞術(shù)和自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)等試驗(yàn)方法，也正是由于這些試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展才促使了定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的發(fā)展[14]。

1.1 高通量

在檢測(cè)低劑量效應(yīng)時(shí)，需要更高的統(tǒng)計(jì)學(xué)效能來(lái)區(qū)別更微小的差異，因此需要計(jì)數(shù)比傳統(tǒng)方法高百倍、甚至幾萬(wàn)倍單位數(shù)量的細(xì)胞或分子。若使用傳統(tǒng)分析方法要耗費(fèi)極大的人力和物力，此時(shí)若使用分析量更高效的方法，如流式細(xì)胞術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)即可達(dá)到理想的統(tǒng)計(jì)學(xué)效能[14-15]。

1.2 高涵蓋面

外源化學(xué)物的低劑量非直線效應(yīng)通常在體內(nèi)試驗(yàn)中觀測(cè)，且由于遺傳毒性終點(diǎn)較多，涉及有害終點(diǎn)的關(guān)鍵分子事件也較多，因此需要更多動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在基于“3R”的原則上，為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用，需要一個(gè)內(nèi)容涵蓋度更廣，即可檢測(cè)更多遺傳學(xué)終點(diǎn)、具有較強(qiáng)整合性的試驗(yàn)方案。具有高兼容能力的遺傳毒性試驗(yàn)方法，如外周血微核計(jì)數(shù)、Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)等是滿(mǎn)足這一條件的理想試驗(yàn)方法。

1.3 高準(zhǔn)確度

試驗(yàn)在低劑量時(shí)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度是高檢驗(yàn)效能的保證。使用客觀的分析方法，如使用圖像分析軟件，可提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確度和精密度。

2 劑量-反應(yīng)關(guān)系的定量分析方法

定量遺傳評(píng)估的最終目的是確定適宜用于外推至人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的PoD，對(duì)于可作為PoD 使用的遺傳毒性閾值仍處于討論中[15]。目前，3 個(gè)認(rèn)可度較高的推導(dǎo)方案為：無(wú)可見(jiàn)遺傳毒性作用水平(no observed genotoxic effect level，NOGEL)、斷點(diǎn)劑量(breakpoint dose，BPD)和基準(zhǔn)劑量(benchmark dose，BMD)，這3 個(gè)方案所得閾值也是IWGT 所推薦的適宜作為PoD外推的遺傳毒性閾值[10]。

2.1 無(wú)可見(jiàn)遺傳毒性作用水平

NOGEL 來(lái)源于一般毒性試驗(yàn)中無(wú)可見(jiàn)有害作用水平(no observed adverse effect level，NOAEL)的定義。NOGEL 在遺傳毒性中概念和計(jì)算方法類(lèi)似與NOAEL，即與對(duì)照組相比不引起相應(yīng)遺傳毒性終點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義升高的最高劑量水平，低于該劑量可能存在不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平改變。NOAEL在管理毒理學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛，而NOGEL 的推導(dǎo)方法和應(yīng)用也與NOAEL 類(lèi)似，是將遺傳毒性視為一般毒性中的有害作用而制定?？墒褂肈unnett’s、Dunn’s、Dunnett’s T3檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算NOGEL[16]。在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)時(shí)，建議可同時(shí)進(jìn)行趨勢(shì)性檢驗(yàn)[17]。特別是在具有較多劑量組的時(shí)候，趨勢(shì)性檢驗(yàn)可增加NOGEL的參考價(jià)值。

2.2 斷點(diǎn)劑量

根據(jù)遺傳毒性作用模式(modes of action，MoA)，某些外源化學(xué)物(如氧化物)在低劑量下的劑效關(guān)系可能為一個(gè)曲棍形態(tài)，也就是雙直線模型(圖1A)。BPD即是針對(duì)這一遺傳毒性作用特征，基于雙線性模型(bi-linear)所推算的遺傳毒性閾值。在這一模型當(dāng)中，劑量-反應(yīng)關(guān)系為兩條直線交匯，低劑量時(shí)的直線斜率為0，較高劑量時(shí)為具有一定斜率的另一條直線。Lutz 等[18]和Muggeo 等[19]最初對(duì)雙線性模型及其計(jì)算方法進(jìn)行了詳細(xì)描述，且該模型已成功應(yīng)用于藥品奈非那韋(viracept)的EMS污染事件中人類(lèi)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[12]。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，通常選用BPD 的95%可信區(qū)間下限(the lower bound of breakpoint dose，BPDL)作為PoD。

BPD 在應(yīng)用于計(jì)算PoD 時(shí)具有一定的缺陷。BPD 將化學(xué)物的劑量-反應(yīng)關(guān)系擬合為兩條簡(jiǎn)單的直線，而Crump[20]的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)假設(shè)的劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線類(lèi)型均可與雙線性模型良好擬合，且由BPD 推算出的BPDL 常包括0 值，不能用作PoD的推算。此外BPD 在劑量擬合時(shí)較BMD 更依賴(lài)于劑量組的數(shù)量、劑量設(shè)計(jì)間距和統(tǒng)計(jì)學(xué)效力[21]，因此IWGT 建議應(yīng)在充分考慮化學(xué)物MoA的基礎(chǔ)上使用BPD作為PoD，且若最終選擇該方法推算人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)時(shí)應(yīng)更為慎重[10]。目前BPD可通過(guò)R軟件中的drsmooth 軟件包計(jì)算，使用的模型為Segmented Hockey Stick Test。

2.3 基準(zhǔn)劑量

BMD是基于特定軟件和模型推算出的，相對(duì)于背景發(fā)生的特定反應(yīng)水平改變的劑量(圖1B)。BMD方法是將所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)納入模型進(jìn)行擬合，由最適宜的模型推算出發(fā)生特定反應(yīng)水平改變時(shí)的一系列劑量。試驗(yàn)前確定的特定反應(yīng)水平稱(chēng)為基準(zhǔn)反應(yīng)水平(benchmark response，BMR)，由此計(jì)算出的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)可信區(qū)間下限稱(chēng)為基準(zhǔn)劑量下限(the lower bound of benchmark dose，BMDL)[22]。根據(jù)數(shù)據(jù)類(lèi)型的不同(分類(lèi)或連續(xù)型變量)、預(yù)設(shè)BMR 的不同(例如可設(shè)為5%或10%)、以及可信區(qū)間的不同(例如可為90%或95%)，BMDL可包括一系列數(shù)值。因此在推算BMDL 時(shí)需要充分考慮數(shù)據(jù)類(lèi)型、有害作用的生物學(xué)意義和研究目的等因素。BMD 在一般毒性評(píng)估中的應(yīng)用已經(jīng)較成熟[23-24]，而在近年來(lái)定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中也開(kāi)始使用這一方法計(jì)算PoD[25-26]。

圖1 EMS肝細(xì)胞彗星試驗(yàn)BPD和BMD模型擬合圖

BMD 是一個(gè)較穩(wěn)健的推算PoD 的方法，較NOAEL 和BPD而言，BMD受劑量設(shè)計(jì)間距的影響最小，且僅需要3個(gè)劑量組即可進(jìn)行擬合。若BMDL 來(lái)源于擬合優(yōu)度最好的模型時(shí)，BMDL 的數(shù)值較BPDL 和NOAEL 而言應(yīng)是最保守的數(shù)值[10]。目前可用于計(jì)算BMD 的軟件為荷蘭國(guó)家公共衛(wèi)生與環(huán)境研究所(the Dutch National Institute for Public Health and the Environment，RIVM)開(kāi)發(fā)的PROAST[27]和美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(U.S.Environmental Protection Agency， U.S. EPA) 開(kāi) 發(fā) 的BMDS software[28]。

IWGT 和ILSI-HESI 推 薦 的PoD 采 納 順 序 為：BMDL＞NOGEL＞BPDL。由于BMD 模型充分考慮了所有數(shù)據(jù)和劑量組且較為保守，因此被推薦作為計(jì)算PoD 的首選方法[10]。用于推算PoD的3種方法的優(yōu)劣總結(jié)于表1。

表1 NOGEL、BMD和BPD方法比較

3 定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在管理毒理學(xué)中的意義

相對(duì)于以往的定性評(píng)估，定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有更顯著的實(shí)際意義。在傳統(tǒng)評(píng)價(jià)模式上，食品、藥品中若存在遺傳毒性污染物，主要風(fēng)險(xiǎn)管理策略為將暴露降至可能性的最低(reduce exposure to as low as reasonably achievable，ALARA)[29]。使用這一方法不僅大大加重了各方的負(fù)擔(dān)，也使管理者無(wú)法區(qū)分風(fēng)險(xiǎn)的大小。IWGT、ILSI-HESI采用加拿大衛(wèi)生部對(duì)遺傳毒性的解釋?zhuān)J(rèn)為在管理毒理學(xué)上遺傳毒性更應(yīng)視為一個(gè)“善意”(bona fide)的保護(hù)性終點(diǎn)，而非在傳統(tǒng)意義上來(lái)說(shuō)類(lèi)似于致癌性的有害結(jié)局終點(diǎn)[10，14，30]。基于該理論，使用定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法確定物質(zhì)的遺傳毒性劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線，可用于推算人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)的暴露范圍(margin of exposure，MOE)。若將遺傳毒性視為一個(gè)具有保護(hù)性的終點(diǎn)，甚至可用于建立類(lèi)似于一般毒性的暴露限值的遺傳毒性參考劑量[14，31]。MOE的計(jì)算和參考劑量的建立有利于風(fēng)險(xiǎn)管理者對(duì)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)較高的物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)先評(píng)估和管理，也有助于公眾和管理者在風(fēng)險(xiǎn)交流時(shí)對(duì)于不同情況下人群遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)大小的理解。

另一方面，定量外推人類(lèi)致癌性風(fēng)險(xiǎn)需要?jiǎng)游镏掳┬匝芯炕蛄餍胁W(xué)研究數(shù)據(jù)[29]，而這兩類(lèi)研究則需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源，且大部分物質(zhì)的研究數(shù)據(jù)并不充分。此外，由于遺傳毒性物質(zhì)在環(huán)境中廣泛存在，污染的發(fā)生常難以避免和預(yù)測(cè)。而當(dāng)實(shí)際污染發(fā)生時(shí)，使用定性評(píng)價(jià)方法難以評(píng)估實(shí)際暴露后的風(fēng)險(xiǎn)大小，而所需定量體內(nèi)致癌性數(shù)據(jù)通常難以獲得。由于基于物質(zhì)遺傳毒性劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線所得的PoD 可用于人體健康風(fēng)險(xiǎn)的外推和MOE的計(jì)算，使用定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可有效解決上述兩項(xiàng)問(wèn)題。2007年羅氏公司發(fā)生藥物EMS污染事件則是定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)際應(yīng)用的成功事例。該年羅氏公司提供的艾滋病病毒蛋白酶抑制劑奈非那韋發(fā)生了EMS 污染，導(dǎo)致病人長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月暴露于低劑量的EMS。歐盟藥品管理局使用定量評(píng)估方法對(duì)此次事件的實(shí)際暴露進(jìn)行了評(píng)估，得出了暴露劑量不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害的結(jié)論[32]。

需要注意的是，不論是從生物學(xué)意義上或是從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上，目前還沒(méi)有關(guān)于遺傳毒性背景水平升高的明確界定[10]。從生物學(xué)上來(lái)說(shuō)，很難說(shuō)明超過(guò)自發(fā)突變水平的微小改變對(duì)人類(lèi)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)和致癌性風(fēng)險(xiǎn)的影響；從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度，幾乎所有的生物學(xué)數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上都存在一個(gè)可計(jì)算的閾值。因此關(guān)于遺傳毒性閾值的理解和應(yīng)用還需要更進(jìn)一步的研究和討論。然而，IWGT和ILSI-HESI仍認(rèn)為遺傳毒性閾值的確立和定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的實(shí)際意義[31，33]。定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可通過(guò)獲得遺傳毒性劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線外推人類(lèi)的健康風(fēng)險(xiǎn)，最終可為避免人類(lèi)遺傳毒性和致癌性風(fēng)險(xiǎn)升高采取切實(shí)可行的保護(hù)措施。

4 小結(jié)和展望

定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的理念近年來(lái)得到了迅速的發(fā)展，其得益于一系列高通量、高涵蓋面、高準(zhǔn)確度的自動(dòng)化試驗(yàn)方法的建立，也反向促進(jìn)了這些試驗(yàn)方法的迅速發(fā)展。定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是在實(shí)際暴露情況的基礎(chǔ)上對(duì)人類(lèi)的采取的保護(hù)性措施，相對(duì)于傳統(tǒng)遺傳毒性評(píng)價(jià)和管理模式具有更強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義和保護(hù)性。盡管目前國(guó)際上還未建立關(guān)于遺傳毒性劑量-反應(yīng)關(guān)系的定量評(píng)估指南，也還沒(méi)有建立將定量遺傳風(fēng)險(xiǎn)毒性評(píng)估如何用于管理毒理學(xué)決策的指南，但定量遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略和其伴隨的新興試驗(yàn)方法可能將會(huì)對(duì)外源化學(xué)物遺傳毒性的評(píng)估和管理帶來(lái)較大影響。