譚道鵬 杜藝玫 秦琳

【摘 要】 目的：測(cè)定大風(fēng)艾藥材中總黃酮和3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的含量。方法：總黃酮含量采用分光光度法測(cè)定，于271nm處測(cè)定;3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮含量采用高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱為AKZONOBEL Kromasil 100-5C18（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇（A） -0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～10min， 45%A; 10～20min， 80%A），流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為289nm，柱溫為30℃。結(jié)果：總黃酮線性范圍為8.26～66.05μg/mL，R2=0.9997，加樣回收率為100.5%;3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮線性范圍為2.06～825.6μg/mL，R2=1，加樣回收率為101.7%。結(jié)論：該方法可作為艾納香的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】 大風(fēng)艾;總黃酮;含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）1-0039-05

Abstract：Objective To determine the contents of total flavonoids and 3，3′，5，7-tetrahydroxy-4′-methoxyflavanone in Blumea balsamifera. Methods The content of total flavonoids was determined with Vis-UV spectrophotometry; The wavalength was set at 271nm;3，3′，5，7-tetrahydroxy-4′-methoxyflavanone was used as the control， the samples were separated on an AKZONOBEL Kromasil 100-5C18（4.6×250mm，5μm） column with the mobile phase consisting of methanol（A）-0.4% phosphoric acid（B） by gradient elution program（0～10min， 45%A; 10～20min， 80%A） at the flow rate of 1.0mL/min， UV detection wavelength at 289nm， and the column temperature was 30℃. Results The standard curve was linear in the range of 8.26～66.05μg/mL， R2=0.9997 for total flavonoids and the average recoveries was 100.5%; and the linear range of 3，3′，5，7-tetrahydroxy-4′-methoxyflavanone was 2.06～825.6μg/mL，R2=1 and the average recoveries was 101.7%. Conclusions The methods are simple， sensitive and accurate， and can be used for quality control of Blumea balsamifera.

Keywords：Blumea balsamifera;Total Flavonoids;Content Determination

大風(fēng)艾又稱艾納香，為菊科植物艾納香Blumea balsamifera的干燥地上部分，具有溫中活血、調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)除濕之功效[1]。該藥材主要含揮發(fā)油（單萜）、黃酮、倍半萜類成分[2]，其中黃酮類成分由黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）兩種類型組成[3-5]。目前，艾納香藥材主要用于提取艾片（左旋龍腦），其黃酮類成分也已被開(kāi)發(fā)為中藥5類新藥，并進(jìn)入II期臨床[4]。黃酮類成分具有多種生物活性，如抗氧化[6]、抗心肌缺血[7]等。為綜合開(kāi)發(fā)利用艾納香中的黃酮類成分，建立快速、準(zhǔn)確的艾納香總黃酮含量測(cè)定方法具有重要應(yīng)用價(jià)值。

中國(guó)藥典中總黃酮含量測(cè)定方法主要有分光光度法和高效液相色譜法兩種。其中分光光度法又可分為顯色后比色法，如山楂葉中總黃酮的含量測(cè)定通過(guò)加NaNO2Al（NO3）NaOH顯色[8]，消咳喘糖漿中的總黃酮含量通過(guò)AlCl3 [8]顯色后測(cè)定和直接比色法，如淫羊藿中的總黃酮含量測(cè)定[8];高效液相色譜法主要是通過(guò)水解后測(cè)定主要黃酮苷元，再根據(jù)轉(zhuǎn)換系數(shù)折算出樣品中總黃酮的含量，如銀杏葉中的總黃酮醇苷的含量測(cè)定[8]。加入AlNO3或AlCl3顯色可以使黃酮類成分紫外光譜吸收帶I（300～400nm）波長(zhǎng)發(fā)生紅移，從而避免其他成分的干擾，使得總黃酮測(cè)定結(jié)果盡可能減少誤差，但由于二氫黃酮類成分其吸收帶I不明顯，不適合采用加Al3+試劑顯色法測(cè)定含有二氫黃酮類成分的總黃酮含量。直接比色法適用于主要含有一類成分的藥材，對(duì)于本文中含有兩種類型黃酮成分的藥材，因其紫外吸收完全不同，以任一類黃酮的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定其總黃酮含量都會(huì)導(dǎo)致其結(jié)果偏低。銀杏葉中通過(guò)水解測(cè)定黃酮苷元來(lái)折算總黃酮的含量由于經(jīng)過(guò)色譜柱的分離，其結(jié)果更為準(zhǔn)確，但僅適用于苷元類型相同的黃酮苷類成分。

艾納香中總黃酮的測(cè)定方法也有報(bào)道，文獻(xiàn)[9]中以蘆丁加NaNO2-Al（NO3）-NaOH顯色后的于500nm波長(zhǎng)處測(cè)定，同樣是將黃酮類成分的吸收帶I紅移后測(cè)定的，但艾納香中除了黃酮（醇）外，還有二氫黃酮類成分[3-5]，而二氫黃酮類成分的吸收帶I是不明顯的（如圖1），因此，該方法會(huì)導(dǎo)致其總黃酮含量測(cè)定結(jié)果偏低。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)艾納香藥材中黃酮類成分研究[3-5]發(fā)現(xiàn)其黃酮類成分主要包括黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）兩種類型，兩種不同類型黃酮的紫外吸收?qǐng)D譜完全不同（如圖1），現(xiàn)有文獻(xiàn)測(cè)定總黃酮含量的方法主要針對(duì)單一類型的黃酮類成分，為此，本文擬探索含有兩種類型黃酮的艾納香中總黃酮含量的紫外測(cè)定方法，為以艾納香總黃酮作為有效成分的制劑原料藥材的質(zhì)量控制提供參考。

艾納香藥材中單體有效成分的含量測(cè)定也有報(bào)道，如：艾納香素和二氫黃酮醇[10]、原兒茶酸[11]等，但這些成分在艾納香中的含量并不高，而含量較高的3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的含量測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道，并且藥理活性研究表明3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移有顯著抑制作用[12]，本文對(duì)其進(jìn)行了HPLC含量測(cè)定方法學(xué)研究。

1 儀器和試藥

島津UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)，Agilent 1100 series 高效液相色譜儀（在線脫氣、自動(dòng)進(jìn)樣、VWD檢測(cè)器、Agilent Chemistation for LC system 色譜工作站）。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-200707）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定院，3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對(duì)照品（批號(hào)20150801）為自制，純度經(jīng)NMR、HPLC檢測(cè)，其他試劑為分析純。

艾納香藥材分別購(gòu)自廣西、貴州，經(jīng)作者鑒定為艾納香Blumea balsamifera，樣品標(biāo)本保存于遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮適量，加甲醇制成1mL中含0.4mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取艾納香藥材粉末0.2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇25mL，稱定重量，回流提取60min，放冷，再稱定重量，以80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品母液，精密吸取供試品母液3mL，以80%甲醇稀釋到100mL，作為供試品溶液。

2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 艾納香中的黃酮類成分由黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）四種類型組成，其中，黃酮（醇）類化合物有兩個(gè)紫外吸收帶，峰帶I（300～400nm）和峰帶II（200～280nm），代表性化合物如蘆丁;二氫黃酮（醇）類化合物的峰帶I很弱，主峰帶II（270～295nm），代表性化合物如3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮;等濃度的蘆丁與3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮在271nm處有相等的吸光度（如圖1），而艾納香中的另外兩類主要成分：揮發(fā)油（單萜）、倍半萜因缺少共軛系統(tǒng)在271nm不會(huì)產(chǎn)生干擾。因此，選擇271nm為測(cè)定波長(zhǎng)，采用紫外分光光度法測(cè)定艾納香中的總黃酮含量。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、6、8mL置50mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0 μg/mL對(duì)照品溶液為空白，在271nm處測(cè)定上述系列對(duì)照品溶液的吸光度。以吸光度y為縱坐標(biāo)，濃度x （μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=23.646x+0.0038;R2=0.9997。結(jié)果表明：3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮在8.26～66.05μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.1.5 精密度試驗(yàn) 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，連續(xù)測(cè)定5次，由吸收度計(jì)算RSD為0.04%。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次艾納香藥材6份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，分別測(cè)定吸收度，并計(jì)算出樣品中總黃酮平均含量為12.1%，RSD為1.69%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，在一定時(shí)間段內(nèi)（0， 15， 30， 60， 120， 180， 240min）測(cè)定吸收度，計(jì)算RSD為0.10%，結(jié)果表明供試品溶液在240min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知總黃酮含量的艾納香藥材6份，分別加入3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，分別測(cè)定吸收度，并計(jì)算出平均加樣回收率為100.51%，RSD為2.57%。

2.2 3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取總黃酮測(cè)定項(xiàng)下的對(duì)照品溶液2mL，加80%甲醇稀釋到10mL，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取總黃酮測(cè)定項(xiàng)下的供試品母液作為供試品溶液。

2.2.3 色譜條件及適用性試驗(yàn) 色譜柱：AKZONOBEL Kromasil 100-5C18（4.6×250mm，5μm）;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～10min， 45%A; 10～20min， 80%A）;流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：289nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10μL。色譜圖如圖2所示。2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱定3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對(duì)照品適量，配置成濃度分別為2.06、4.12、10.32、20.64、41.28、123.84、412.8、825.6μg/mL的系列對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μL，進(jìn)液相測(cè)定，以峰面積y為縱坐標(biāo)，濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=32.418x+27.17;R2=1。結(jié)果表明：3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮在2.06～825.6μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，連續(xù)測(cè)定5次，根據(jù)峰面積計(jì)算RSD為0.62%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次艾納香藥材6份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，分別測(cè)定，并計(jì)算出樣品中3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮平均含量為1.2%，RSD為1.85%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取艾納香藥材1份，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，在一定時(shí)間段內(nèi)（0， 1， 2， 4， 8， 12， 18h）測(cè)定峰面積。結(jié)果表明供試品溶液在18h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.40%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知總黃酮含量的艾納香藥材6份，分別加入3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下操作，制備成供試品溶液，分別測(cè)定，并計(jì)算出平均加樣回收率為101.74%，RSD為3.00%。

2.2.9 樣品測(cè)定 取3批艾納香藥材分別按上述方法測(cè)定其總黃酮及3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

分光光度法是一種中藥總成分分析的常用方法，但由于中藥中的成分非常復(fù)雜，采用分光光度法測(cè)定某一類總成分時(shí)極易受到其它類成分的干擾，因此需要對(duì)樣品中的化學(xué)成分充分的了解，選擇出適合的方法以保證方測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。黃酮類成分是自然界普遍存在一種重要天然產(chǎn)物，黃酮類成分具有多種多樣的活性，一直受到天然藥物研究學(xué)者的關(guān)注。黃酮類成分根據(jù)其結(jié)構(gòu)又可細(xì)分為多種類型，如黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）、查爾酮、黃烷、雙黃酮等，艾納香藥材中含有豐富的黃酮類成分，主要以黃酮（醇）、二氫黃酮（醇）兩種類型為主。這兩種類型的黃酮紫外吸收?qǐng)D譜完全不同（如圖1），從圖中可以看出以任何一種類型黃酮類成分的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定其總黃酮含量都會(huì)因另一種黃酮類成分在相應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)處的吸收值較低而造成測(cè)定結(jié)果較實(shí)際含量低。等吸收波長(zhǎng)是指在某一波長(zhǎng)處相同濃度的兩種化學(xué)成分具有相同的紫外吸收值，通過(guò)配置相同濃度的兩種化學(xué)成分分別繪制其紫外吸收?qǐng)D譜疊加后，在其紫外吸收?qǐng)D譜交叉處即為這兩種化學(xué)成分的等吸收波長(zhǎng)。由于相同濃度的不同類型化學(xué)成分在等吸收波長(zhǎng)處的吸收值是相同的，因此可采用等吸收波長(zhǎng)不經(jīng)分離，直接同時(shí)測(cè)定不同類型化學(xué)成分的含量[13- 14]，并減少誤差。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘆丁與3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮有三個(gè)等吸收波長(zhǎng)，其中271nm具有較好的吸收，同時(shí)又可避免末端波長(zhǎng)的干擾，因此選作本實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定艾納香中不同類型黃酮的總含量，方法學(xué)研究結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、方便、快捷，可以作為藥材、中間體及制劑的控制方法。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別對(duì)總黃酮及3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的提取條件進(jìn)行了考察，結(jié)果表明0.2g艾納香藥材采用25mL80%甲醇回流提取1h可以提取完全。本實(shí)驗(yàn)對(duì)艾納香藥材中的總黃酮及主要黃酮單體化學(xué)成分3，3′，5，7-四羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含量分別達(dá)到7.2～12.3%及0.8～1.4%，具有非常高的開(kāi)發(fā)利用前景。

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（收稿日期：2019-10-18 編輯：劉斌）