本刊記者：東 來

實(shí)驗(yàn)確證血清HBV RNA的來源并探索其潛在臨床意義

乙型肝炎病毒（HBV）感染可引起急、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化、失代償性肝硬化和肝癌，是嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。存在于感染肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）是病毒復(fù)制模板，也是HBV持續(xù)復(fù)制和建立持久感染的重要根源。核苷（酸）類藥物（NAs）治療可有效阻 斷H B V松弛 環(huán)狀DNA（rcDNA）的合成，導(dǎo)致慢性乙肝患者血清中HBV DNA迅速下降至低于檢測(cè)下限。然而，此時(shí)患者體內(nèi)的cccDNA可能仍在活躍轉(zhuǎn)錄。由于有創(chuàng)傷性，臨床上難以普遍開展肝穿刺活組織檢查，以檢測(cè)肝組織內(nèi)cccDNA存在及其活性。探索能夠反映肝組織內(nèi)cccDNA活性的替代血清學(xué)指標(biāo)具有十分重要的意義。2016年，魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)證實(shí)血清中的HBV RNA為存在于病毒核衣殼內(nèi)的未經(jīng)或部分逆轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA（pgRNA）?；颊唧w內(nèi)除了HBV DNA病毒顆粒外，還有“HBV RNA病毒樣顆?！钡拇嬖?。由于血清HBV RNA來自于感染肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的pgRNA，且不易受NAs的影響，理論上應(yīng)能反映病毒復(fù)制模板cccDNA的存在和轉(zhuǎn)錄活性，可作為反映肝組織內(nèi)cccDNA活性或狀態(tài)的替代血清學(xué)指標(biāo)。

目前，各國(guó)指南均有鞏固治療后停藥的建議，但由于無法預(yù)判停藥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，這些建議往往缺乏可操作性。針對(duì)這一問題，魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，接受NAs鞏固治療的患者如果血清中HBV RNA陽性往往預(yù)示著更高的停藥后發(fā)生病毒反彈和疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，甚至對(duì)于那些經(jīng)抗病毒治療后發(fā)生HBsAg陰轉(zhuǎn)的慢乙肝患者，如果停藥時(shí)血清HBV RNA陽性，仍然有發(fā)生病毒反彈的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)此，他們提出了血清HBV DNA和HBV RNA均持續(xù)消失（低于檢測(cè)下限）這一新的完全病毒學(xué)應(yīng)答定義，并以此為基礎(chǔ)修訂了“部分治愈”的定義，提出了“準(zhǔn)臨床治愈”的概念。其中，修訂的“部分治愈”指的是慢乙肝患者經(jīng)抗病毒治療后肝功能恢復(fù)正常，血清HBV DNA和HBV RNA持續(xù)低于檢測(cè)下限，RNA指標(biāo)的納入將會(huì)大大提高原來定義的停藥后持續(xù)維持病毒學(xué)應(yīng)答的可能性；而“準(zhǔn)臨床治愈” 則是在“部分治愈”的基礎(chǔ)上將血清HBsAg水平低于1500 IU/mL作為重要的參考指標(biāo)，以在長(zhǎng)期接受NAs抗病毒治療的患者中，明確哪些人更易于獲得臨床治愈，并和臨床專家一起提出了以臨床治愈為目標(biāo)的優(yōu)化治療路徑的建議。該建議以患者血清HBV RNA陽性與否為參考指標(biāo)，對(duì)“準(zhǔn)臨床治愈”的患者采取加用Peg-IFN的聯(lián)合治療或換用Peg-IFN的序貫治療，以期使更多的慢乙肝患者能夠?qū)崿F(xiàn)臨床治愈。通過慢乙肝抗病毒治療階梯式“治愈”的建議，期望有助于推動(dòng)慢乙肝臨床治愈的精準(zhǔn)治療路徑，最終有助于更多的慢乙肝患者實(shí)現(xiàn)臨床治愈。

發(fā)現(xiàn)NAs治療下產(chǎn)生的HBV病毒顆粒主要為復(fù)制缺陷型，并明確了監(jiān)測(cè)復(fù)制全能性HBV DNA的潛在臨床意義

NAs是目前應(yīng)用最廣泛的抗HBV藥物，該類藥物的主要作用機(jī)制是與天然核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的同類物競(jìng)爭(zhēng)，摻入正在逆轉(zhuǎn)錄合成的HBV負(fù)鏈DNA、或正在合成的子代病毒正鏈DNA中，從而使新鏈延伸被提前終止，抑制病毒基因組DNA的復(fù)制。理論上講，NAs的摻入將導(dǎo)致新合成HBV DNA鏈的不可逆終止，使“子代病毒”失去感染性。為證明這一點(diǎn)，魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NAs的摻入的確可導(dǎo)致子代病毒顆粒內(nèi)新合成病毒DNA鏈的不可逆終止，導(dǎo)致HBV“子代病毒”難以建立感染。該研究為抗病毒治療阻斷母嬰垂直傳播和肝移植病人的水平傳播補(bǔ)充了理論依據(jù)，為NAs治療慢乙肝的應(yīng)答機(jī)制提供了更為全面的解釋。

我國(guó)存在一定比例的HBV隱匿性感染者（OBI）。OBI仍可使疾病慢性進(jìn)展，導(dǎo)致肝硬化甚至肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生。而且，OBI患者是潛在的HBV傳染源，可通過輸血、器官移植和母嬰密切接觸等方式進(jìn)行傳播。此外，在免疫機(jī)能下降或進(jìn)行免疫抑制治療時(shí)，部分OBI患者可出現(xiàn)HBV再激活。所以O(shè)BI的檢測(cè)和診斷尤為重要。魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)認(rèn)為cccDNA和/或rcDNA的存在均表征了HBV發(fā)生病毒再激活和再感染的潛能，實(shí)驗(yàn)室診斷OBI僅需要排除HBV整合DNA片段帶來的干擾，而不必刻意地區(qū)分cccDNA和rcDNA。據(jù)此他們提出了OBI定義的更新建議：排除HBV感染窗口期，按照現(xiàn)有血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)HBsAg陰性，但肝組織中H B V r c D N A或cccDNA（即復(fù)制全能性HBV DNA）陽性，對(duì)應(yīng)血清HBV DNA低于檢測(cè)下限或低值陽性（ ＜ 200 IU/mL）的 OBI更 新 定義，并建立了單跨缺口PCR體系檢測(cè)復(fù)制全能性HBV DNA，以期將來用于OBI的臨床診斷，推動(dòng)OBI人群的診療及管理。

增殖肝細(xì)胞膜定位NTCP蛋白表達(dá)抑制與慢乙肝患者獲得更佳的病毒學(xué)應(yīng)答相關(guān)

有肝臟炎癥損傷的慢乙肝患者與處于免疫耐受期的慢性HBV感染者相比更易于獲得良好的病毒學(xué)應(yīng)答。有文獻(xiàn)報(bào)道在感染肝細(xì)胞增殖過程中cccDNA會(huì)被不斷稀釋和丟失，可能產(chǎn)生cccDNA清除的新生肝細(xì)胞，有助于HBV的控制和清除。處于增殖狀態(tài)的新生肝細(xì)胞對(duì)HBV再感染存在抵抗，但機(jī)制不清。2012年，鈉離子/?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTCP）被我國(guó)學(xué)者鑒定為HBV感染肝細(xì)胞的功能性受體。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，NTCP表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位與 HBV 感染密切相關(guān)。魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜定位的NTCP低表達(dá)可進(jìn)一步保護(hù)那些cccDNA清除的新生肝細(xì)胞不被感染。該研究部分闡明了臨床上肝臟炎癥活動(dòng)度高的慢乙肝患者可以獲得良好病毒學(xué)應(yīng)答的原因，為現(xiàn)行指南推薦的對(duì)肝臟有中度以上炎癥的慢乙肝患者進(jìn)行積極抗病毒治療提供新的理論支持。

通過基因編輯技術(shù)探索清除HBV cccDNA的途徑，追求慢乙肝臨床治愈

研發(fā)直接靶向cccDNA的藥物，尋找清除cccDNA的新方法和新策略，是當(dāng)前治療慢乙肝新藥物新技術(shù)研發(fā)的熱點(diǎn)。魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)首先通過HBV特異的雙向?qū)NAs（guide RNA，gRNA）介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)cccDNA的高效破壞，進(jìn)一步通過模擬自然界microRNA（miRNA）的生成過程，研發(fā)出了R N A干擾聯(lián)合雙gRNAs導(dǎo)向的CRISPR/Cas9技術(shù)，在基因轉(zhuǎn)錄抑制和靶向破壞cccDNA兩個(gè)層次上探索HBV cccDNA 清除 新路徑。為了安全有效地將CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送至患者體內(nèi)并發(fā)揮其基因編輯功能，魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)探索了細(xì)胞來源外泌體傳遞功能性gRNA和Cas9蛋白、實(shí)現(xiàn)靶向清除cccDNA 的可能性。實(shí)驗(yàn)證明具有較高安全性的外泌體有可能成為CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向HBV cccDNA的一種安全、有效的遞送方式。

明確了血清高爾基體蛋白73（GP73）的臨床意義

目前肝纖維化、肝硬化的診斷尚缺乏特異度和靈敏度高的“無創(chuàng)”診斷標(biāo)志物。魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)血清GP73能夠很好地反映慢性肝病患者中肝纖維化、肝硬化的進(jìn)展情況，并初步確定了血清GP73對(duì)慢乙肝、丙肝及非酒精性脂肪肝等不同病因所致的不同階段肝纖維化、肝硬化的診斷界值。為了提高診斷的準(zhǔn)確性，將血清GP73與其他血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)用，建立了適應(yīng)于我國(guó)乙肝肝硬化聯(lián)合診斷模型GAPA。應(yīng)用該診斷模型，患者可通過血清學(xué)檢測(cè)較為準(zhǔn)確地判斷肝纖維化、肝硬化的進(jìn)程階段，有助于為患者提供有效臨床干預(yù)，減少包括肝癌在內(nèi)的終末期肝病發(fā)生。他們還發(fā)現(xiàn)，血清GP73不僅與肝纖維化的進(jìn)程密切相關(guān)，與肝臟炎癥活動(dòng)的情況也是顯著相關(guān)?？紤]到臨床上仍需要反應(yīng)肝臟炎癥活動(dòng)度的微創(chuàng)指標(biāo)。該團(tuán)隊(duì)與國(guó)內(nèi)學(xué)者合作，通過多中心臨床隊(duì)列分析發(fā)現(xiàn)GP73聯(lián)用AST、GGT的HIM模型對(duì)中度及以上的肝臟炎癥具有穩(wěn)定且良好的診斷價(jià)值，準(zhǔn)確性在90%左右。并且，HIM診斷模型在那些ALT不升高但伴有明顯得肝臟炎癥的慢乙肝患者中仍然展現(xiàn)出良好的診斷效能，這將有助于醫(yī)生判斷用藥的時(shí)機(jī)，及時(shí)使患者得到有效的干預(yù)。

挖掘肝臟彈力指數(shù)在肝臟炎癥中的診斷價(jià)值

魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)多中心研究結(jié)果顯示，在慢乙肝、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病等慢性肝病中，LSM均隨肝臟炎癥活動(dòng)度的加重而逐步升高。其中在慢乙肝患者，LSM對(duì)中度及以上的肝臟炎癥診斷價(jià)值優(yōu)于ALT和AST。在非酒精性脂肪肝中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于ALT。這對(duì)有進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的非酒精性脂肪肝患者給予及時(shí)治療，從而減緩疾病進(jìn)展和并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。

研究論證了血清甲胎蛋白（AFP）在我國(guó)HBV感染相關(guān)HCC篩查和診斷中的價(jià)值

我國(guó)80%以上的HCC由HBV感染引起。然而，約2/3的HCC患者在診斷時(shí)已處于疾病的中晚期，失去了最佳的治療時(shí)機(jī)。早期甚至是極早期發(fā)現(xiàn)和診斷肝癌，并給予其根治性治療是改善肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)鍵。血清AFP被應(yīng)用于肝癌患者的臨床檢測(cè)中。但血清AFP在活動(dòng)性肝炎、肝硬化患者中有相當(dāng)比例的假陽性升高，影響了血清AFP在篩查和診斷肝癌時(shí)的靈敏度和特異度，降低了相應(yīng)的篩查和診斷效能。魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗病毒治療的患者血清AFP水平會(huì)相對(duì)較低，而特異度則相應(yīng)有所提高。據(jù)此他們建議，對(duì)于接受抗病毒治療的慢乙肝及肝硬化患者，相應(yīng)地降低血清AFP臨床界值以提高篩查和診斷靈敏度，并聯(lián)合超聲等影像學(xué)手段以利于早期肝癌的發(fā)現(xiàn)。

挖掘影響肝癌患者術(shù)后生存的標(biāo)志物

魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)通過對(duì)肝癌患者術(shù)后隨訪隊(duì)列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)前紅細(xì)胞計(jì)數(shù)越高的患者術(shù)后生存情況越好，并認(rèn)為紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與肝功能的相關(guān)性可能是其能夠反映肝癌患者術(shù)后預(yù)后情況的主要原因。還發(fā)現(xiàn)，血清載脂蛋白B是獨(dú)立的肝癌預(yù)后因素。血清前白蛋白又被稱為轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白，主要在肝臟中合成。由于其在體內(nèi)總量明顯少于白蛋白，半衰期僅1.9天，因此與白蛋白相比，其能更敏感的反映肝臟功能和營(yíng)養(yǎng)狀況。他們發(fā)現(xiàn)肝癌患者術(shù)前血清前白蛋白是Child A級(jí)患者的預(yù)后保護(hù)因素，術(shù)前前白蛋白高（男性>190 mg/L，女性>170 m g/L）、中（男性120～190mg/L，女性110～170mg/L）和低（男性<120mg/L，女性<110mg/L）組患者的中位生存期分別為49.85、26.25、和11.02個(gè)月。并據(jù)此構(gòu)建了新的改良的MCP肝功能評(píng)分系統(tǒng)，納入前白蛋白指標(biāo)后的MCP分級(jí)系統(tǒng)的術(shù)后生存期預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)性遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)Child-Pugh系統(tǒng)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)白球比（A/G）較低的患者其肝功能、凝血功能較差，腫瘤進(jìn)展情況嚴(yán)重，其可以作為術(shù)前評(píng)估預(yù)后情況的指標(biāo)之一，為臨床醫(yī)生篩選術(shù)后預(yù)后較好的患者行肝癌根治術(shù)提供了更多參考。

魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)在近年的工作中證實(shí)了血清中HBV RNA病毒樣顆粒的存在，完善了HBV的復(fù)制周期；以血清HBV DNA、RNA雙檢測(cè)陰性為指標(biāo)重新定義了病毒學(xué)應(yīng)答，并結(jié)合HBsAg定量（≤1500IU/mL）提出準(zhǔn)臨床治愈的概念；明確提出血清HBV RNA檢測(cè)可用于評(píng)估接受NAs鞏固治療慢乙肝患者的停藥風(fēng)險(xiǎn)，及對(duì)特殊NAs經(jīng)治患者追求臨床治愈的治療路徑建議；以復(fù)制全能性HBV DNA （rcDNA/cccDNA）存在與否為依據(jù)更新了OBI的定義。此外，有關(guān)NTCP在活躍增殖表達(dá)抑制和肝細(xì)胞膜定位異常的研究使我們認(rèn)識(shí)到，在有明顯活動(dòng)性肝臟炎癥患者中，一方面cccDNA隨細(xì)胞增殖而減少甚至丟失，另一方面肝細(xì)胞增殖狀態(tài)可使其抵抗HBV再感染和新感染發(fā)生，而NAs治療下子代HBV DNA和“HBV RNA病毒樣顆?！备腥救毕菪钥蛇M(jìn)一步減少增殖肝細(xì)胞新發(fā)感染的發(fā)生，使該類患者更易獲得病毒學(xué)應(yīng)答。魯鳳民教授團(tuán)隊(duì)有關(guān)GP73的研究為我們提供了一個(gè)新的肝臟炎癥、肝硬化相關(guān)的血清標(biāo)志物。上述研究在一定程度上改善了我們的慢性肝病管理，有助于患者獲得更好的治療。