鄭子龍，陳雨珊，楊旭,2，曾燕，李金泉,*

1. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，腦科學(xué)先進(jìn)技術(shù)研究院，武漢 430081 2. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079

在工業(yè)化、城市化和全球變暖三重壓力下，我國(guó)城市臭氧(ozone, O3)的污染風(fēng)險(xiǎn)不斷提高。城市臭氧污染主要是指城市近地面臭氧，是由氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)物等臭氧前體物質(zhì)，在強(qiáng)烈的陽(yáng)光紫外線照射下，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成主要成分為臭氧的光化學(xué)煙霧。近年來(lái)，隨著我國(guó)“大氣十條”方案的逐步落實(shí)，空氣質(zhì)量改善顯著，PM2.5濃度下降明顯，但是臭氧污染的勢(shì)頭卻持續(xù)上升，導(dǎo)致在我國(guó)許多地區(qū)臭氧已超越PM2.5成為夏秋季各地空氣首要污染物[1-4]。我國(guó)生態(tài)環(huán)境部2019年空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)顯示，全國(guó)337個(gè)地級(jí)及以上城市臭氧平均濃度同比上升6.5%，高達(dá)148 μg·m-3，接近我國(guó)空氣質(zhì)量臭氧污染紅線160 μg·m-3。作為一種強(qiáng)氧化劑，臭氧幾乎可與任何生物組織反應(yīng)并引起不利健康的影響。臭氧暴露會(huì)引起氣道炎癥、導(dǎo)致氣道狹窄、支氣管反應(yīng)性增加和肺功能下降[5]。此外，暴露于臭氧與患有阻塞性肺疾病(例如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)的患者癥狀惡化、呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率增加緊密相關(guān)[6-7]。Francis等[8]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于臭氧后，趨化因子受體2(CCR2)在肺中的促炎和抗炎巨噬細(xì)胞積累中均起作用。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體活性氧(mtROS)和NLRP3炎性體均在臭氧誘導(dǎo)的肺部炎癥中起作用。然而，雖然臭氧污染帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)已受到普遍關(guān)注，但相關(guān)防治策略及其生物學(xué)機(jī)制仍不清楚，亟待深入研究。

核因子E2相關(guān)因子2 (Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，在編碼抗氧化劑和/或排毒酶和相關(guān)壓力響應(yīng)蛋白的基因的啟動(dòng)子區(qū)域中起重要作用[10-11]。Nrf2可調(diào)節(jié)血紅素加氧酶1(HO-1)、NADPH:醌氧化還原酶1(NQO-1)和γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)等抗氧化酶，以減輕炎癥損害并中和炎性損傷引起的細(xì)胞/組織的活性氧(ROS)[12]。氧化/抗氧化失衡被認(rèn)為在肺部炎癥損傷中起到重要作用。激活以Nrf2為代表的抗氧化酶系統(tǒng)能夠減輕氧化應(yīng)激引起的肺損傷，但其在抑制臭氧吸入毒性從而減輕肺部炎癥中的作用仍有待研究。褪黑素(melatonin, MT)是一種松果體激素，有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等多種生理功能[13]，可抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激[14-15]，保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA免受氧化損傷[16]。因此，本研究通過構(gòu)建小鼠臭氧急性暴露模型，觀察臭氧暴露對(duì)肺組織氧化應(yīng)激和炎癥損傷的相關(guān)指標(biāo)，通過抗氧化劑MT的處理，探究MT是否通過激活Nrf2及其下游抗氧化酶拮抗臭氧誘發(fā)小鼠急性肺部損傷，以期驗(yàn)證臭氧暴露誘導(dǎo)的肺部損傷機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠，購(gòu)買于湖北省疾病預(yù)防控制中心(國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，6～8周齡，體重(22±2) g，飼養(yǎng)于華中師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h晝夜循環(huán)光照，溫度保持在22～24 ℃，濕度為40%～60%，小鼠飲食飲水充足供應(yīng)。臭氧暴露前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要儀器

KTB便攜式臭氧發(fā)生器(廣州創(chuàng)環(huán)臭氧電器設(shè)備有限公司)，KP836便攜式臭氧檢測(cè)儀(江蘇羽翼科技有限公司)、DW-HL100型-80 ℃超低溫冰箱(中科美菱有限公司，中國(guó))、5415R低溫冷凍離心機(jī)(艾本德有限公司，德國(guó))、DNM-9602全長(zhǎng)酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，中國(guó))、Dancer/MS3渦旋儀(艾卡儀器設(shè)備有限公司，德國(guó))、移液器(艾本德有限公司，德國(guó))、CFX96 Real-time PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，美國(guó))。

1.3 主要試劑和檢測(cè)試劑盒

褪黑素(Sigma公司，美國(guó))、小鼠IL-1β(貨號(hào)：88-7013-22，靈敏度：8 pg·mL-1)、IL-33(貨號(hào)：88-7333-22，靈敏度：25 pg·mL-1)、IL-4(貨號(hào)：88-7044-22，靈敏度：4 pg·mL-1)、IL-17A(貨號(hào)：88-7371-22，靈敏度：4 pg·mL-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(eBioscience公司，美國(guó))，小鼠微量GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))，BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(生工生物工程股份有限公司，中國(guó))，戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國(guó))，硫代巴比妥酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，中國(guó))，蘇木精和伊紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，中國(guó))，多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，中國(guó))，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))，Nrf2、HO-1和NQO-1引物(生工生物工程股份有限公司，中國(guó))。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和染毒方案

將24只Balb/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為：(1)生理鹽水對(duì)照組(Control)；(2)褪黑素對(duì)照組(MT)；(3)臭氧暴露組(2.14 mg·m-3O3)；(4)臭氧暴露+褪黑素保護(hù)組(2.14 mg·m-3O3+MT)。連續(xù)進(jìn)行7 d，每天上午8:00到11:00對(duì)臭氧暴露組與臭氧暴露+褪黑素保護(hù)組小鼠進(jìn)行2.14 mg·m-3的臭氧暴露，臭氧由便攜式臭氧發(fā)生器產(chǎn)生，根據(jù)便攜式臭氧檢測(cè)儀調(diào)節(jié)進(jìn)氣流量；對(duì)照組小鼠暴露于潔凈空氣。臭氧暴露后對(duì)MT組和2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠按5 mg·kg-1濃度口服MT保護(hù)劑，連續(xù)進(jìn)行7 d。臭氧暴露濃度2.14 mg·m-3是參考已發(fā)表以及本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定的[17-19]。

1.5 小鼠肺泡灌洗液的提取

滅菌手術(shù)剪剝離小鼠頸部氣管至清晰暴露，氣管上段橫切剪一個(gè)0.1 cm左右小口，將氣管插管插入到小鼠氣管中固定，按壓小鼠肺部以排除其肺部空氣。分別注入1、0.8和0.8 mL生理鹽水至氣管插管中，輕輕揉壓小鼠肺部，使生理鹽水充分接觸肺部后緩慢回收3次肺泡灌洗液(BALF)保存。

1.6 肺組織勻漿制備

用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗取出的小鼠肺組織，用吸水紙吸干后稱重，放入滅菌的2 mL玻璃勻漿器(上海信裕生物科技有限公司，中國(guó))中，加入預(yù)冷的PBS制備成10%的肺組織勻漿液，8 000 ×g、4 ℃離心10 min，取上清分裝后置于低溫環(huán)境保存。

1.7 小鼠肺組織病理切片

取部分肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，脫水后進(jìn)行石蠟切片(5 μm)與蘇木精-伊紅染色(H&E stain)，于DM4000B光學(xué)顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)有限公司，德國(guó))下觀察肺組織切片染色結(jié)果，并拍照分析。

1.8 各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的測(cè)定，均采用商用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。

還原型谷胱甘肽(GSH)含量測(cè)定：2-硝基苯甲酸(DTNB)可以在黑暗的條件下與GSH反應(yīng)形成黃色化合物1,3,5-三硝基苯(TNB)，在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，同時(shí)采用GSH標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH的含量。使用改良的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。

硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)含量：MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。取200 μL肺組織勻漿液，加入800 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的TBA溶液，沸水浴15 min后，8 000 ×g、4 ℃下離心10 min，取上清液200 μL于酶標(biāo)板，分別在450、532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按照公式CMDA=(6.45(OD532 nm-OD600 nm)-0.56OD450 nm)/Cprotein，計(jì)算出MDA含量(μmol·g-1protein)。樣品蛋白質(zhì)濃度使用改良的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定。

目的基因mRNA表達(dá)測(cè)定：Trizol法提取總mRNA，對(duì)mRNA含量及純度進(jìn)行測(cè)定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明建立反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)目的基因引物進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定，最后采用2-△△CT法分析目的基因表達(dá)情況。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR測(cè)試的引物序列Table 1 Primer sequence for RT-qPCR

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，利用Graph Pad8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，組間各指標(biāo)比較均采用單因素方差分析，隨后進(jìn)行Holm-Sidak多重比較檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠肺組織病理學(xué)改變

如圖1所示，與對(duì)照組相比，2.14 mg·m-3O3組小鼠氣道發(fā)生了明顯的重塑現(xiàn)象，包括氣道壁增厚，氣道腔變得狹窄，并且炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著性增加；與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道重塑現(xiàn)象均顯著減輕。

圖1 不同處理組小鼠肺組織蘇木精-伊紅染色圖注：MT表示褪黑素；(a)對(duì)照組(生理鹽水組)，(b) MT(5 mg·kg-1)處理組，(c) 2.14 mg·m-3 O3處理組，(d) 2.14 mg·m-3 O3+MT(5 mg·kg-1)處理組。Fig. 1 H&E stain of lung section of mice in different treatment groupsNote: MT stands for melatonin; (a) control group (saline group), (b) MT (5 mg·kg-1) treatment group, (c) 2.14 mg·m-3 O3 treatment group, (d) 2.14 mg·m-3 O3+MT (5 mg·kg-1) treatment group.

2.2 小鼠肺組織細(xì)胞因子含量的變化

如圖2所示，與對(duì)照組相比，MT處理組并沒有引起小鼠肺組織中IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的含量發(fā)生顯著性改變；2.14 mg·m-3O3組的IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠肺組織IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子含量注：**表示P<0.01，與生理鹽水組相比；##表示P<0.01，與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 2 Cytokine concentration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of miceNote: **represents P<0.01, compared with the control group; ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

2.3 小鼠肺組織GSH和MDA含量的變化

如圖3所示，與對(duì)照組相比，2.14 mg·m-3O3組的GSH含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；MDA含量顯著性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MT組GSH和MDA含量無(wú)明顯改變。與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組肺組織GSH含量上升，MDA含量下降，且均具有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 小鼠肺組織谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，與對(duì)照組相比；##表示P<0.01，與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 3 The content of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in mice lungNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01, compared with the control group; ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

2.4 Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

如圖4所示，與對(duì)照組相比，2.14 mg·m-3O3組小鼠肺部Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MT單獨(dú)作用并不會(huì)造成肺組織中Nrf2、HO-1和NQO-1表達(dá)量發(fā)生改變；與2.14 mg·m-3O3組相比，2.14 mg·m-3O3+MT組的小鼠肺組織Nrf2、NQO-1和HO-1的表達(dá)量都發(fā)生上調(diào)，且均具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。

圖4 Nrf2與抗氧化基因NQO-1和HO-1的表達(dá)注：Nrf2代表核因子-E2相關(guān)因子2基因，HO-1代表血紅素加氧酶1基因，NQO-1代表NADPH:醌氧化還原酶1基因；**表示P<0.01，與生理鹽水組相比，#表示P<0.05、##表示P<0.01，與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 4 Expression of Nrf2 and antioxidant genes NQO-1 and HO-1Note: Nrf2 stands for nuclear factor E2-related factor 2; HO-1 stands for heme oxygenase 1 gene; NQO-1 stands for NADPH:quinone redox enzyme 1 gene; **represents P<0.01, compared with the control group; # represents P<0.05, ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

3 討論(Discussion)

本研究使用Balb/c小鼠，通過構(gòu)建臭氧急性暴露小鼠模型，探究抗氧化劑對(duì)臭氧誘發(fā)肺組織損傷的拮抗作用。研究結(jié)果表明，臭氧暴露后模型小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加劇，氣道重塑，IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A等多種細(xì)胞因子的表達(dá)升高，同時(shí)，抗氧化元件Nrf2及其下游抗氧化酶mRNA表達(dá)下調(diào)，出現(xiàn)更為嚴(yán)重的肺組織氧化損傷。更為重要的是，通過抗氧化劑MT的使用，模型小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平顯著降低。同時(shí)，拮抗了臭氧暴露對(duì)小鼠肺組織造成的炎癥損傷以及病理學(xué)改變。

氧化損傷是機(jī)體氧化還原平衡被打破向氧化水平升高方向轉(zhuǎn)化后造成的細(xì)胞和組織的損傷，在各類過敏性疾病的發(fā)病過程中都起著重要作用[20]。氧化應(yīng)激是多種病理?yè)p傷的關(guān)鍵因素，高水平的氧化應(yīng)激與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和細(xì)胞膜的損傷有關(guān)。臭氧作為具有高度活性的氧化劑，可通過產(chǎn)生ROS導(dǎo)致細(xì)胞毒性[21]，造成組織出現(xiàn)不同程度的損傷[20,22]。體內(nèi)具有可以清除ROS的還原性多肽如GSH，它的消耗可以反映機(jī)體氧化還原平衡被打破的程度[23]。ROS過量后會(huì)造成對(duì)細(xì)胞和組織中脂質(zhì)物質(zhì)的氧化，而MDA則是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。本研究表明，臭氧暴露后肺組織勻漿中MDA含量的上升、GSH含量的下降，表明小鼠肺部氧化還原平衡被打破，造成了明顯的氧化損傷。此外，小鼠肺組織中的細(xì)胞因子IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量顯著上升表明了臭氧暴露在小鼠模型中引發(fā)了明顯的炎癥反應(yīng)。H&E染色也發(fā)現(xiàn)臭氧暴露后小鼠氣道出現(xiàn)重塑和明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

褪黑素是松果體的一種激素，也存在于許多的植物中，該化合物具有多種有利的生物學(xué)和治療活性，例如用于抗氧化劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、抗糖尿病藥和心臟保護(hù)劑的生產(chǎn)[24-25]。Ding等[26]的研究表明，在實(shí)驗(yàn)性腦外傷中，褪黑素可刺激抗氧化酶活性并降低氧化應(yīng)激效應(yīng)。本研究擬通過口服暴露褪黑素減輕臭氧暴露對(duì)小鼠肺部造成的損傷。研究結(jié)果表明，褪黑素處理后，臭氧暴露組小鼠肺組織MDA含量顯著性下降，GSH含量顯著性上升；且肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量也顯著性下降。這表明，褪黑素的使用不僅可以降低肺組織中的氧化損傷，還可以抑制炎癥反應(yīng)，減輕肺組織病理學(xué)的改變。Nrf2是氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中的一種強(qiáng)大的氧化還原傳感器，也是啟動(dòng)許多抗氧化基因的基本要素[27]。在本實(shí)驗(yàn)中，沒有經(jīng)過臭氧暴露的小鼠由于體內(nèi)的氧化還原處于平衡狀態(tài)，所以MT的單獨(dú)作用并不會(huì)引起Nrf2的活化及其相關(guān)抗氧化基因HO-1和NQO-1的表達(dá)。但是，當(dāng)臭氧暴露后，肺組織中的氧化還原平衡被打破，此時(shí)MT可以通過激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)其抗氧化功能。

綜上所述，臭氧急性暴露能顯著增加小鼠肺組織中的氧化應(yīng)激和炎癥水平，造成肺組織病理學(xué)改變和損傷；而抗氧化劑的使用可增加Nrf2及其下游抗氧化酶的表達(dá)，有效降低臭氧暴露后小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平，拮抗臭氧對(duì)小鼠肺組織的炎癥損傷，進(jìn)一步驗(yàn)證了臭氧暴露引起的肺部損傷是通過氧化性損傷機(jī)制介導(dǎo)的。