郭煊，王學(xué)東,*，李菊梅，馬義兵

1. 首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院，北京 100048 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081 3. 澳門科技大學(xué)澳門環(huán)境研究院，澳門 999078

中國(guó)的銻(Sb)儲(chǔ)量大約3.0×106～3.5×106t，超過(guò)世界Sb儲(chǔ)量的50%[1]。根據(jù)美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局國(guó)家礦產(chǎn)信息中心公布的數(shù)據(jù)，中國(guó)在2018年仍然是全球最大的Sb生產(chǎn)國(guó)，占全球Sb產(chǎn)量的70%以上[2]。

近幾年間，由于采礦和冶煉、垃圾焚燒、煤炭和石油燃燒等人類活動(dòng)日益頻繁，越來(lái)越多的Sb元素進(jìn)入到環(huán)境中[3]。Sb礦的開(kāi)采對(duì)周邊環(huán)境影響較為明顯，在中國(guó)湖南省錫礦山礦區(qū)采礦和冶煉過(guò)程中產(chǎn)生了大量的固體廢物，礦山北部沿廢物堆和尾礦池的徑流處觀察到最高的Sb濃度達(dá)到39.16 mg·L-1[3]，與世界其他受污染地點(diǎn)報(bào)告的最高Sb濃度相似[4]。對(duì)安徽省3個(gè)煤礦采集的33個(gè)土壤樣品分析發(fā)現(xiàn)超過(guò)75%的樣品出現(xiàn)嚴(yán)重的Sb污染[5]。

Sb是一種對(duì)動(dòng)植物均存在毒害作用的元素，可造成動(dòng)物組織病變，植物生長(zhǎng)不良、枯萎等毒性影響。林祥龍等[6]對(duì)跳蟲(chóng)進(jìn)行的Sb毒性試驗(yàn)表明，設(shè)置的濃度范圍內(nèi)Sb(Ⅴ)不會(huì)直接造成其明顯死亡，但會(huì)對(duì)跳蟲(chóng)生理行為和繁殖產(chǎn)生一定毒性影響。對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Sb2O3可引起肺組織炎性病變，肝臟小片壞死，急性實(shí)質(zhì)性心肌炎病變等毒害作用[7]。植物Sb中毒的癥狀主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、葉片瘦小及根系生長(zhǎng)不良，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)葉片發(fā)黃乃至植物枯萎[8-9]。較高的Sb濃度會(huì)顯著抑制葉片和根系生物量的產(chǎn)生，并且Sb在植物中的積累會(huì)導(dǎo)致植物必需營(yíng)養(yǎng)素濃度的變化[10]。

土壤環(huán)境中過(guò)量的Sb會(huì)通過(guò)食物鏈等途徑進(jìn)入人體。Sb對(duì)人體的急性毒性臨床表現(xiàn)為結(jié)膜炎、視神經(jīng)損傷、嘔吐、腹瀉和血尿等癥狀，慢性毒性主要表現(xiàn)為肺功能改變、慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病以及心血管系統(tǒng)和腎臟病變，此外，Sb還具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[11]?；诖?，了解Sb在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化行為對(duì)于預(yù)防和控制土壤Sb污染具有重要意義。

許多研究表明，在土壤溶液中，Sb主要以Sb(Ⅴ)的形式存在。在廣泛的氧化還原條件(360～140 mV)下，Sb僅以五價(jià)形式存在于土壤及土壤孔隙水中[12-13]，即使在厭氧條件下，土壤也可作為促進(jìn)Sb(Ⅲ)氧化的催化劑[14]，可見(jiàn)土壤中以五價(jià)形態(tài)存在的Sb幾乎占總Sb量的90%以上[1]。

環(huán)境中的pH值和氧化還原條件在很大程度上決定了金屬元素的形態(tài)，Wilson等[15]繪制了不同系統(tǒng)下的pe-pH圖，表明了pH值對(duì)Sb的形態(tài)變化具有重要影響。我國(guó)土壤種類復(fù)雜多樣，土壤pH差異大，不同pH土壤Sb毒性可能會(huì)千差萬(wàn)別。pH值通過(guò)改變金屬離子的化學(xué)形態(tài)或者與金屬競(jìng)爭(zhēng)生物配體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)而影響金屬離子的生物有效性和毒性，已有研究表明，pH從4.5到8.5，Cr(Ⅵ)和Ni毒性分別變化了4.73倍和7.28倍，隨pH從4.5升高至8.0，Cu毒性變化了9倍[16-18]。因此，pH值被認(rèn)為是影響金屬離子在土壤中生物有效性的最重要因素[19]。

最近，生物配體模型(BLM)常被用于水體和土壤環(huán)境中量化pH及金屬的一些伴隨離子對(duì)金屬毒性的影響[20]。目前，已有關(guān)于Cu、Ni、Zn、Cd和Cr等金屬元素毒性預(yù)測(cè)BLM的報(bào)道[16-19, 21-22]，但關(guān)于Sb毒性的BLM還鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本研究采用水培試驗(yàn)的方法，探索pH對(duì)Sb毒性的影響及其機(jī)制，并利用BLM理論建立其量化關(guān)系，從而為土壤中Sb風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

化學(xué)試劑：六羥基銻酸鉀(KSb(OH)6)、CaCl2、NaOH、HCl、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid, MES)和3-(N-嗎啡啉)乙磺酸(3-(N-morpholino) propane sulfonic acid, MOPS)，均為分析純，均購(gòu)于北京百靈威科技有限公司。試驗(yàn)用塑料燒杯購(gòu)于北京宏達(dá)科萊科技有限公司。大麥品種采用河南省農(nóng)科院培育的駐大麥六號(hào)。

1.2 溶液配制

采取單因素控制的方法，設(shè)置9個(gè)pH組，分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。在每一個(gè)pH值梯度設(shè)置7個(gè)Sb(Ⅴ)濃度，分別為0、0.0951、0.1902、0.3804、0.7607、1.5215、和3.043 mmol·L-1，溶液pH值采用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)，采用1 mmol·L-1MES(pH<7.0)和3.6 mmol·L-1MOPS(pH≥7.0)作緩沖劑，以往研究證明MES和MOPS不與金屬絡(luò)合，不影響金屬形態(tài)及其毒性[18, 23]。采用0.2 mmol·L-1CaCl2作為背景溶液。所有溶液都使用去離子水配制，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。溶液pH測(cè)定采用pH計(jì)(Delta320; Mettler, Zurich, Switzerland)。

1.3 大麥根伸長(zhǎng)抑制試驗(yàn)

大麥根長(zhǎng)試驗(yàn)采用ISO11269-1方法[24]，使用廣口塑料燒杯作為培養(yǎng)容器，選擇健康飽滿的大麥種子，用去離子水沖洗干凈，放置于底層鋪有滅菌濾紙的玻璃培養(yǎng)皿上，并用去離子水沒(méi)過(guò)種子，在20 ℃、無(wú)光照條件下放置36 h，待胚根長(zhǎng)至2 mm后移至裝有溶液的培養(yǎng)杯中，每杯6個(gè)。培養(yǎng)條件為白天光照14 h，溫度為(24±2) ℃；夜間光照為10 h，溫度為(18±2) ℃。光照強(qiáng)度為25 000 lx。大麥生長(zhǎng)約5 d后測(cè)定根長(zhǎng)，并計(jì)算不同Sb濃度處理下的大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)(RE)(%)。

(1)

式中：REt為不同Sb濃度處理下的根伸長(zhǎng)；REc為對(duì)照根伸長(zhǎng)。

1.4 Sb(Ⅴ)形態(tài)預(yù)測(cè)

Sb(Ⅴ)形態(tài)通過(guò)Visual MINTEQ 3.0計(jì)算(http://hem.bredband.net/b108693/)。輸入的參數(shù)為pH以及Sb(Ⅴ)、K、Ca和Cl的離子濃度，設(shè)置CO2分壓為35.46375 Pa。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和處理

劑量-效應(yīng)曲線用log-logistic方程進(jìn)行擬合[25]：

(2)

式中：y為相對(duì)于對(duì)照組的大麥根伸長(zhǎng)(%)；x為Sb(Ⅴ)濃度；y0、a和b為擬合常數(shù)，a為log10(EC50)。利用擬合曲線求出不同評(píng)價(jià)指標(biāo)的EC50值及其相應(yīng)的95%置信區(qū)間。

1.6 生物配體模型的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)

c(TBL)=c(Sb(OH)6BL)+c(OHBL)+c(ClBL)+c(BL)

(3)

式中：c(TBL)為生物配體的絡(luò)合容量(mol·L-1)；c(XBL)為與陰離子結(jié)合的生物配體活度(mol·L-1)；c(BL)為未被絡(luò)合的自由配體活度(mol·L-1)。

(4)

式中：KXBL為條件結(jié)合常數(shù)，c(Xn-)為陰離子活度。

根據(jù)BLM的假設(shè)，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)離子OH-和Cl-被考慮的時(shí)候，整個(gè)生物配體結(jié)合位點(diǎn)被Sb(Ⅴ)所占據(jù)的比例為f，即分配系數(shù)，其大小與生物量以及總配體數(shù)無(wú)關(guān)，可以表達(dá)為公式(5)。

(5)

當(dāng)達(dá)到50%抑制的時(shí)候，公式(5)可以轉(zhuǎn)化為

(6)

(7)

式中：β為模型參數(shù)。將公式(5)中的f帶入到公式(7)中，可得：

(8)

方程最優(yōu)化檢驗(yàn)采用最小殘差平方和(RMSE)：

(9)

式中：N、n為處理的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)，Robserved大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)實(shí)測(cè)值(%)，Rpredicted為大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)預(yù)測(cè)值(%)。

2 結(jié)果與討論(Results and disscusion)

2.1 不同pH條件下Sb(Ⅴ)的形態(tài)分布

圖1 不同溶液pH下Sb(Ⅴ)的形態(tài)分布Fig. 1 The distribution of different Sb(Ⅴ) species as a function of pH

2.2 pH值對(duì)Sb(Ⅴ)毒性的影響

表1 不同pH條件下Sb(Ⅴ)對(duì)大麥根伸長(zhǎng)的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度(EC50)值及95%置信區(qū)間Table 1 The measured Sb(Ⅴ) toxicity threshold at 50% inhibition (EC50) in the different pH sets for barely root elongation with 95% confidence intervals

圖2 不同pH值下分別以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值變化曲線Fig. 2 The curve of EC50 as a function of pH expressed as (a) and EC50(Sb(OH)5) (b)

圖3 大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)隨和Sb(OH)5 (b)活度變化的劑量效應(yīng)曲線Fig. 3 Dose-response curve of barley root elongation as a function of (a) and Sb(OH)5 (b) activity

圖4 分別以和Sb(OH)5 (b)表示的EC50值與OH-活度的關(guān)系注：圖中實(shí)線為線性擬合結(jié)果。Fig. 4 The relationship between EC50 value and OH- activity expressed as (a) and Sb(OH)5 (b)Note: The solid line in the figure is the linear fitting result.

(10)

式中：KSb(OH)5BL和KOHBL是形成Sb(OH)5與OH-配合物的穩(wěn)定常數(shù)；將公式(10)代入公式(7)中，可得：

(11)

(12)

由上式可知離子濃度與根伸長(zhǎng)RE之間的關(guān)系是非線性的，為了明確式中每個(gè)變量對(duì)RE的影響大小，分別對(duì)自變量進(jìn)行靈敏性分析。控制其他變量不變，調(diào)整公式中某一變量，根據(jù)RE的變化量及斜率大小，可以判斷每個(gè)自變量的靈敏度。靈敏度反映自變量對(duì)RE的貢獻(xiàn)，較高的靈敏性表明該成分與大麥根配體位點(diǎn)有更強(qiáng)的親和力。

本文通過(guò)溶液模擬試驗(yàn)探討了不同pH值對(duì)大麥根伸長(zhǎng)Sb(Ⅴ)毒性的影響，得出的主要結(jié)論如下：

圖5 大麥相對(duì)根伸長(zhǎng)(RE)分別與和Sb(OH)5 (c)的相關(guān)關(guān)系注：圖中實(shí)線為線性擬合結(jié)果。Fig. 5 The relationships between barley root elongation (RE) and OH- (a), (b) and Sb(OH)5 (c)Note: The solid line is the linear fitting result.

圖6 考慮和OH-活度后預(yù)測(cè)的大麥根伸長(zhǎng)與實(shí)測(cè)大麥根伸長(zhǎng)的相關(guān)關(guān)系Fig. 6 Correlation between predicted barley root elongation and measured barley root elongation after considering

(3)依據(jù)BLM方程，通過(guò)線性和非線性擬合獲得BLM參數(shù)，建立了BLM，其預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)具有良好的相關(guān)關(guān)系(r2=0.95，P<0.001)，表明Sb(Ⅴ)的BLM可以很好地預(yù)測(cè)Sb(Ⅴ)對(duì)大麥根伸長(zhǎng)毒性。