牛玥，朱敏，劉芃巖，秦占芬,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 2. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，保定 071002 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

四溴雙酚A(tetrabromobisphenol A, TBBPA)和四氯雙酚A (tetrachlorobisphenol A, TCBPA)作為阻燃劑在塑料、合成纖維等材料中廣泛應(yīng)用[1-3]。目前，TBBPA和TCBPA在多種環(huán)境介質(zhì)、生物樣品乃至人體樣品中均有較高的檢出率[4-9]。Liu等[10]分析了關(guān)于我國(guó)普通水體中TBBPA濃度的報(bào)道，認(rèn)為平均濃度<10 ng·L-1。但在TBBPA污染嚴(yán)重的巢湖水體中，Yang等[11]檢測(cè)到TBBPA濃度為850～4 870 ng·L-1。Wang等[12]的研究結(jié)果顯示，TBBPA在污水中濃度最高可達(dá)19.3 μg·L-1。近幾年，飲用水中TBBPA和TCBPA也被檢出[13]。因此，TBBPA和TCBPA的安全性受到越來越多的關(guān)注。

資料顯示，TBBPA與TCBPA對(duì)水生生物的毒性為中毒或極毒，遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物[14-17]。兩棲動(dòng)物是生物體由水生到陸生的過渡類型，被認(rèn)為是生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要指示類群。目前，關(guān)于TBBPA和TCBPA對(duì)兩棲動(dòng)物毒性的數(shù)據(jù)還相對(duì)較少，未見相關(guān)急性毒性的報(bào)道。另外，化學(xué)品暴露一般會(huì)引起谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase, GST)、硫氧還原蛋白(thioredoxin, TRX)和過氧化氫酶(catalase, CAT)等幾個(gè)氧化應(yīng)激標(biāo)記在轉(zhuǎn)錄水平或者酶活性的變化。曾有研究報(bào)道，低濃度的TBBPA影響斑馬魚體內(nèi)CAT和GPX酶的活性及活性氧(ROS)的濃度[18-19]。鞏文靜等[17]報(bào)道，亞致死濃度下TBBPA導(dǎo)致太平洋真寬水蚤體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激。另外，熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)也是與氧化應(yīng)激相關(guān)的參數(shù)，一些化學(xué)品也可影響HSP27、HSP70和HSP90等幾個(gè)熱激活蛋白的水平[20]。Hu等[18]報(bào)道高濃度的TBBPA影響斑馬魚體內(nèi)hsp70基因的表達(dá)。

本文選擇生態(tài)毒理學(xué)中常用的兩棲類模式種非洲爪蛙，研究了TBBPA和TCBPA的急性毒性以及對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)記物的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的非洲爪蛙成年雌蛙和雄蛙，分養(yǎng)于盛有去氯自來水的玻璃缸中，每個(gè)玻璃缸大約10只成蛙，水溫21～22 ℃，明暗光周期為12 h∶12 h。成蛙喂食豬肝和商品飼料，每周各1次，喂食2 h后換水。

非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU促黃體素釋放激素(LHRH)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，雄蛙注射200～300 IU。將雌雄蛙放于產(chǎn)卵容器中，置于黑暗、安靜的環(huán)境中讓其抱對(duì)，12 h左右即可產(chǎn)卵。受精卵在21～22 °C的去氯自來水中孵化，胚胎發(fā)育至48期的蝌蚪，進(jìn)行暴露試驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

儀器和設(shè)備：高速冰凍離心機(jī)(Centrifuge 5430，Eppendorf，德國(guó))；PCR儀(9700，Applied Biosystem，美國(guó))；熒光定量PCR儀(MX3500P，Strata gene，美國(guó))；組織碾磨儀(MM301，Retsch，德國(guó))；渦旋混勻器(Vortex3000，Wiggens，美國(guó))；全自動(dòng)核酸提取儀(AU1001，北京百泰克生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；電子天平(JA2003B，上海越平科技儀器有限公司，中國(guó))；移液器(Eppendorf，德國(guó))；全自動(dòng)凝膠成像儀(GBOX-HR，Syn Gene，英國(guó))；普通PCR儀(My Cycler TM，Bio-Rad，美國(guó))；電泳儀(DYCP-31F，北京六一儀器廠，中國(guó))。

試劑：TBBPA(純度97%，Acros公司，比利時(shí)；分子量543.88，CAS No.79-94-7)；TCBPA(純度98%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，中國(guó)上海；分子量336.06，CAS No.79-95-8)；二甲基亞砜(DMSO)(純度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司，美國(guó)；CAS No. 67-68-5)；核酸染料(G-red)和RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR試劑盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司，中國(guó)北京)；PCR引物(華大基因，中國(guó)北京)。

1.3 蝌蚪急性毒性試驗(yàn)

TBBPA和TCBPA用助溶劑DMSO配成100 g·L-1的儲(chǔ)備液。設(shè)置溶劑對(duì)照組，其中，溶劑的濃度與處理組溶劑濃度相同，溶劑的體積濃度不超過0.01%。暴露試驗(yàn)在玻璃缸里面進(jìn)行，每個(gè)缸盛有1 L試驗(yàn)液，蝌蚪隨機(jī)放入10尾。每隔24 h換一次水，清除死亡個(gè)體，記錄死亡數(shù)，試驗(yàn)持續(xù)48 h。

在正式試驗(yàn)之前先對(duì)2種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行較大濃度范圍(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的預(yù)試驗(yàn)，不設(shè)平行組，各濃度的缸中加入10尾蝌蚪，觀察記錄48 h蝌蚪死亡數(shù)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的結(jié)果，設(shè)置正式試驗(yàn)濃度。正式試驗(yàn)以1.4為公比設(shè)置了7個(gè)濃度梯度(表1)和溶劑對(duì)照組，每組3個(gè)平行，每個(gè)缸中隨機(jī)加入10尾蝌蚪；其他同預(yù)試驗(yàn)；重復(fù)2次正式試驗(yàn)。

表1 正式暴露實(shí)驗(yàn)中四溴雙酚A(TBBPA)和四氯雙酚A(TCBPA)的濃度Table 1 Concentrations of tetrabromobisphenol A (TBBPA) and tetrachlorobisphenol A (TCBPA) in exposure experiments

1.4 RNA提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

每個(gè)缸隨機(jī)取2尾蝌蚪，用全自動(dòng)核酸提取儀提取RNA，超微量分光光度計(jì)(51119500C，Thermo Fisher Scientific，美國(guó))測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳來確定RNA完整性。然后根據(jù)Fast Quant RT Kit(with g DNase)說明書配制20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)SYBR Green PCR Kit說明，配制10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃變性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每個(gè)基因在使用之前都進(jìn)行了擴(kuò)增效率的驗(yàn)證，計(jì)算公式為E=(10-1/slope-1)×100。擴(kuò)增效率在90%～110%之間，溶解曲線單一且重合，不存在非特異性擴(kuò)增的基因才可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行基因表達(dá)分析時(shí)，以rpl8為管家基因?qū)Ω鱾€(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[21]?；虻南鄬?duì)表達(dá)量根據(jù)公式2-ΔΔCT計(jì)算[22]。引物及相關(guān)信息如表2所示。

表2 RT-qPCR引物及相關(guān)信息Table 2 Primers sequences and relevant information on RT-qPCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)單元為缸，即n值等于平行缸數(shù)[21]。重復(fù)2次正式試驗(yàn)，得到相似的結(jié)果，在文中只呈現(xiàn)其中一次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[23]?；貧w分析使用Probit模型，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，并計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)值及其95%置信區(qū)間。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error of mean, SEM)表示。暴露組中以各自的參照相比的顯著性差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，P值<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TBBPA與TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性

溶劑對(duì)照組無死亡，表明試驗(yàn)質(zhì)量控制良好。TBBPA和TCBPA暴露組蝌蚪的死亡率變化如圖1所示。24 h時(shí)，6.00mg·L-1TBBPA和8.00 mg·L-1TCBPA暴露組的蝌蚪存活率均為0。3.06 mg·L-1和4.28 mg·L-1的TBBPA暴露組蝌蚪的存活率分別為97%和53%，4.08 mg·L-1和5.71 mg·L-1的TCBPA暴露組蝌蚪的存活率分別為27%和10%，其他濃度暴露組的蝌蚪均無死亡現(xiàn)象發(fā)生。48 h時(shí)，全部暴露組蝌蚪的存活率均未發(fā)生改變。觀察蝌蚪死亡現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)，6 mg·L-1TBBPA暴露組加入TBBPA后，蝌蚪沉到水底，不再游動(dòng)，24 h后全部死亡，8 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪的死亡現(xiàn)象同6 mg·L-1TBBPA暴露組。4.28 mg·L-1TBBPA與5.71 mg·L-1TCBPA暴露組存活蝌蚪的心臟與尾部周圍觀察到明顯的凝血現(xiàn)象，TBBPA和TCBPA的濃度分別低于3.06 mg·L-1和2.92 mg·L-1時(shí)不再發(fā)生凝血現(xiàn)象。

圖1 TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪存活率的影響Fig. 1 Effects of TBBPA and TCBPA on survival rates of Xenopus laevis tadpoles

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得到TBBPA和TCBPA對(duì)蝌蚪的24 h-LC50分別為4.31 mg·L-1和3.99 mg·L-1，48 h-LC50與24 h-LC50相同(表3)。TBBPA與TCBPA的毒性相當(dāng)。

表3 TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪的半數(shù)效應(yīng)濃度(LC50)及其95%置信區(qū)間和回歸方程Table 3 The median lethal concentration (LC50), 95% confidence interval and regression equations of TBBPA and TCBPA to Xenopus laevis tadpoles

2.2 TBBPA與TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

RT-qPCR結(jié)果表明，暴露48 h后，0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)gst和trx這2種基因的轉(zhuǎn)錄水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖2)。3.06 mg·L-1TBBPA暴露組與2.92 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)gr基因的轉(zhuǎn)錄水平被顯著促進(jìn)。0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA蝌蚪體內(nèi)cat和gpx基因的轉(zhuǎn)錄水平呈倒“U”型趨勢(shì)，0.79 mg·L-1和1.12 mg·L-1TBBPA暴露組和1.06 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)的cat和gpx基因的相對(duì)表達(dá)量被顯著上調(diào)。

圖2 TBBPA(a)和TCBPA(b)對(duì)非洲爪蛙體內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄的影響注：*P<0.05，與對(duì)照組相比。Fig. 2 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on oxidative stress marker genes in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

2.3 TBBPA與TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄的影響

RT-qPCR結(jié)果表明，暴露48 h后，0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA和1.06～2.92 mg·L-1的TCBPA對(duì)蝌蚪體內(nèi)的hsp27基因的轉(zhuǎn)錄水平無顯著性影響(圖3)。TBBPA及TCBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)hsp70和hsp90基因的轉(zhuǎn)錄水平與TBBPA及TCBPA暴露濃度呈“倒U型”關(guān)系，且TBBPA濃度為1.12 mg·L-1時(shí)，蝌蚪體內(nèi)hsp70和hsp90的轉(zhuǎn)錄水平被顯著上調(diào)；當(dāng)TCBPA濃度為1.06 mg·L-1時(shí)，蝌蚪體內(nèi)hsp90的轉(zhuǎn)錄水平被顯著上調(diào)。

圖3 TBBPA(a)和TCBPA(b)對(duì)非洲爪蛙體內(nèi)熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄的影響注：*P<0.05，與對(duì)照組相比。Fig. 3 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on heat shock protein genes in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

2.4 TBBPA與TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)凝血基因轉(zhuǎn)錄的影響

TBBPA和TCBPA暴露組蝌蚪心臟與尾部出現(xiàn)凝血現(xiàn)象(圖4)。因凝血現(xiàn)象的出現(xiàn)，選擇f2、f10和serpina基因作為指標(biāo)，探究TBBPA與TCBPA對(duì)蝌蚪體內(nèi)凝血基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于TBBPA和TCBPA 48 h后，凝血基因f2、f10和serpina的表達(dá)有一定的變化趨勢(shì)(圖5)：0.79～3.06 mg·L-1的TBBPA促進(jìn)蝌蚪體內(nèi)凝血基因f2、f10和serpina的轉(zhuǎn)錄水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系，并在3.06 mg·L-1表現(xiàn)出顯著性差異；TCBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)f2、f10和serpina基因的轉(zhuǎn)錄水平與TCBPA濃度(1.06～2.92 mg·L-1)呈“倒U型”關(guān)系，1.06 mg·L-1和1.49 mg·L-1的TCBPA顯著促進(jìn)蝌蚪體內(nèi)f2基因的轉(zhuǎn)錄水平，1.49 mg·L-1的TCBPA顯著促進(jìn)蝌蚪體內(nèi)f10和serpina的轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 TBBPA和TCBPA暴露48 h導(dǎo)致的非洲爪蛙蝌蚪心臟和尾部凝血現(xiàn)象注：(a)和(d)為對(duì)照；(b)和(e)為TBBPA暴露組；(c)和(f)為TCBPA暴露組。Fig. 4 Coagulation phenomenon in hearts and tails of Xenopus laevis tadpoles following 48 h-exposure to TBBPA and TCBPANote: (a) and (d) are control group; (b) and (e) are TBBPA group; (c) and (f) are TCBPA group.

圖5 TBBPA(a)和TCBPA(b)對(duì)非洲爪蛙體內(nèi)凝血因子轉(zhuǎn)錄的影響注：*P<0.05，與對(duì)照組相比。Fig. 5 Transcriptional effects of TBBPA (a) and TCBPA (b) on coagulation gene in Xenopus laevisNote: *P<0.05, compared with the control.

3 討論(Discussion)

本研究結(jié)果表明，TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50分別為4.31 mg·L-1和3.99 mg·L-1。根據(jù)國(guó)家關(guān)于危險(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分類準(zhǔn)則，TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙的毒性均為中等毒性[24]。Song等[25]的研究表明，TBBPA和TCBPA對(duì)斑馬魚的LC50分別為0.75 mg·L-1和1.24 mg·L-1，毒性分別為高毒和中毒；Hallgren等[15]報(bào)道了TBBPA對(duì)大鼠的半數(shù)致死劑量(LD50)為10 g·kg-1，毒性為微毒?？傮w來看，TBBPA對(duì)非洲爪蛙的毒性與水生生物斑馬魚類似，而遠(yuǎn)高于對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性。另外，研究發(fā)現(xiàn)TBBPA和TCBPA均導(dǎo)致蝌蚪心臟和尾部產(chǎn)生凝血現(xiàn)象，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

TBBPA和TCBPA顯著上調(diào)非洲爪蛙體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因gst和trx的轉(zhuǎn)錄水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系，TBBPA和TCBPA對(duì)蝌蚪體內(nèi)gr基因轉(zhuǎn)錄水平的影響呈“升高-平臺(tái)期-升高”的趨勢(shì)，并在TBBPA與TCBPA的最高濃度暴露組表現(xiàn)出顯著性差異。gst、trx和gr基因的轉(zhuǎn)錄水平與氧化應(yīng)激效應(yīng)呈正相關(guān)。對(duì)比TBBPA與TCBPA相似濃度暴露組(如1.12 mg·L-1TBBPA暴露組與1.06 mg·L-1TCBPA暴露組)蝌蚪體內(nèi)gst、trx和gr的轉(zhuǎn)錄水平后發(fā)現(xiàn)，TBBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)gst、trx和gr基因的相對(duì)表達(dá)量均與TCBPA暴露組類似。TCBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)cat和gpx基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與TBBPA相同，呈先升高后降低的倒“U”型趨勢(shì)。綜上所述，TBBPA和TCBPA誘導(dǎo)非洲爪蛙蝌蚪產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，二者效應(yīng)相當(dāng)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前關(guān)于雙酚A替代品與雙酚A對(duì)非洲爪蛙毒性的研究，發(fā)現(xiàn)無論是BPA及BPA替代品(BPF和BPAF)還是BPA的衍生物(TBBPA和TCBPA)對(duì)非洲爪蛙幾個(gè)經(jīng)典氧化應(yīng)激標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響都十分顯著，尤其對(duì)gst基因的影響，均呈良好的線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。

TBBPA與TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)的影響表明，TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙體內(nèi)hsp27基因的轉(zhuǎn)錄水平無顯著性影響，1.12 mg·L-1TBBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)的hsp70與hsp90轉(zhuǎn)錄水平被顯著上調(diào)，1.06 mg·L-1TCBPA暴露組蝌蚪體內(nèi)hsp90的轉(zhuǎn)錄水平被顯著上調(diào)，TBBPA和TCBPA對(duì)蝌蚪體內(nèi)hsp70和hsp90的轉(zhuǎn)錄水平的影響整體均呈先升高后降低的“倒U型”?？傮w來看，TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙體內(nèi)熱休克蛋白的影響不大，只有個(gè)別濃度會(huì)引起hsp70和hsp90基因的微弱表達(dá)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前關(guān)于雙酚A替代品與雙酚A對(duì)非洲爪蛙毒性的研究，發(fā)現(xiàn)BPA、BPA替代品和BPA的衍生物對(duì)熱休克蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響均不顯著。

綜上所述，TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪的毒性相近均為中毒，與對(duì)水生生物斑馬魚的毒性類似，遠(yuǎn)高于對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性；TBBPA和TCBPA對(duì)非洲爪蛙蝌蚪的氧化應(yīng)激效應(yīng)也接近，但不引起熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄的變化。