林 玥， 劉紅梅， 謝裕安

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,實驗研究部，南寧 530021)

肝細胞癌是消化道常見腫瘤，在原發(fā)性肝癌中約占90%[1]。肝癌起病隱匿，探究早期診斷的生物標志物，可以為診斷和評估肝癌患者預(yù)后提供有價值的信息[2]。溶膠蛋白超家族是一類鈣離子依賴性肌動蛋白結(jié)合蛋白，在生理和病理細胞的運動中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其通過調(diào)控肌動蛋白細胞骨架參與腫瘤的發(fā)生和進展[3]。凝溶膠蛋白超家族成員中幾大核心成員如凝溶膠蛋白(GSN)[4]、絨毛膜蛋白(Villin)[5]、加帽蛋白(CapG)[6]是潛在的腫瘤標志物，這一觀點已經(jīng)得到中外研究證實[7]。Advillin(AVIL)是凝溶膠蛋白家族的新成員，與凝溶膠蛋白家族成員共享6個凝溶膠蛋白同源(GH)結(jié)構(gòu)域，具有對肌動蛋白捆綁、結(jié)合的功能[8]。前人對Advillin的研究主要集中在Advillin與Villin相似的序列方面[9]，而其在腫瘤中的研究鮮有報道。

為此，基于Advillin與Villin具有極其相似的序列和功能的前提下，推測AVIL是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個新的生物標志物，采用免疫組化驗證的方法，分析AVIL基因在原發(fā)性肝細胞癌與癌旁組織的表達差異，探討其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性以及預(yù)后的關(guān)系，以期為肝細胞癌相關(guān)研究提供新的觀點。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性收集2013年10月—2016年12月于廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院行肝癌根治術(shù)并具有完整資料的76例原發(fā)性肝癌患者，所有病例手術(shù)標本均經(jīng)病理證實為肝細胞性肝癌且固定于10%福爾馬林并行常規(guī)石蠟包埋，所有病例均無術(shù)前放療或化療等輔助治療史。所有標本獲取過程均按照倫理程序，并獲得醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 臨床資料

臨床分期根據(jù)BCLC分期進行劃分。肝細胞癌分化程度分級采用的Edmondson分級法。

76例原發(fā)性肝癌組織中，男性66例，女性10例；年齡28～77歲，平均年齡53.2歲；有腫瘤家族史16例，無腫瘤家族史60例；臨床BCLC分期，A～B期50例，C期26例；腫瘤直徑<5 cm者26例，≥5 cm者50例；病理Edmondson分級，I～II期41例，III～IV期35例；伴有癌栓者36例，無癌栓者40例；腫瘤多灶性35例，無多灶性者例41例；伴有AFP<8.04 ng/mL者26例，8.04 ng/mL者50例；伴有ALT<40 U/L者48例，40 U/L者28例；伴有AST<37 U/L者35例，37 U/L者41例；伴有γ-GT<50 U/L者35例，50 U/L者41例；伴有HBsAg者68例，無HBsAg者8例；伴有肝硬化者48例，無肝硬化者28例；腫瘤轉(zhuǎn)移患者19例，非轉(zhuǎn)移患者57例。同時選取對應(yīng)的76例癌旁組織作為對照。

隨訪結(jié)束截至2019年3月12日，其中死亡患者23例；失訪2例；存活51例。將死于肝癌記為終點事件，其他情況則記為截尾事件，生存時間均按月計算。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗人AVIL單克隆抗體(1∶150)購自英國Abcam公司；即用型SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)、檸檬酸抗原修復(fù)液(干粉)、蘇木素購自福建邁新生物技術(shù)有限公司；中性樹脂、二甲苯、多濃度梯度乙醇、烤箱等均由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部提供。

1.4 免疫組化染色及結(jié)果判讀

采用免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法)對石蠟切片組織進行檢測，具體操作方法按照試劑說明書進行。結(jié)果判讀：每張切片隨機選擇5個高倍視野(×400)，每個視野下計數(shù)100個腫瘤細胞，根據(jù)染色細胞百分率計分標準:0 分為≤10%，1 分為11%～25%，2 分為26%～50%，3 分為51%～75%，4 分為>75%；染色強度的計分標準:無著色計為0 分，淺棕色計為1 分，棕色計為2 分，深棕色計為3 分。上述兩項分值之和判斷其結(jié)果:0 分為陰性(-)，2 ～ 3分為弱陽性(+)，4 分為中度陽性(++)，5 ～ 6 分為強陽性(+++)。得分≥4分為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入和分析，兩組表達差異以及表達水平與臨床參數(shù)間關(guān)系均采用χ2檢驗。生存曲線采用Kaplan-Meier法、Cox比例風(fēng)險回歸模型進行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌與癌旁中組織中AVIL的表達水平

AVIL蛋白主要表達于肝細胞癌組織中，其在肝細胞癌中陽性率為64.5%，而在配對癌旁組織中多為低表達，陽性率僅為43.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.779，P=0.009<0.05)，如表1、圖1所示。

表1 AVIL在肝癌及配對癌旁組織中的蛋白表達水平

注：*表示該值P<0.01。

圖1 AVIL基因在肝細胞癌和癌旁組織中的蛋白表達水平

2.2 AVIL表達與肝細胞癌患者臨床參數(shù)之間的關(guān)系

統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，AVIL表達與肝細胞癌患者BCLC分期、Edmondson分級有關(guān)(P<0.05)，而AVIL表達與患者性別、年齡、有無腫瘤家族史、腫瘤大小、AFP、ALT、AST、γ-GT、HBsAg、有無癌栓、有無多灶性、有無肝硬化、有無轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05，表2)。相比臨床早期(BCLC-A～B期)的患者，AVIL蛋白表達在臨床晚期(BCLC-C期)患者中的表達明顯升高(P<0.05)。相比病理分級低(Edmondson I～II期)的患者，AVIL蛋白表達在病理分級高(Edmondson III～IV期)患者中的表達明顯升高(P<0.05)，如表2所示。

表2 AVIL差異表達水平與肝癌患者各臨床參數(shù)之間的關(guān)系

注：**表示采用Fisher精確概率法；△表示該值P<0.05。

2.3 AVIL表達與肝癌患者生存時間的關(guān)系

將免疫組化染色的76例肝癌樣本根據(jù)其表達值劃分成AVIL低表達(<4分)組和AVIL高表達(≥4分)組，采用Kaplan-Meier生存分析法，結(jié)果表明，AVIL蛋白高表達組肝癌患者的生存時間顯著低于低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖2所示。單因素分析表明，AVIL表達水平、BCLC分期、腫瘤大小、有無癌栓、有無多灶性、AFP、AST、γ-GT、有無肝外轉(zhuǎn)移與肝細胞癌癌患者預(yù)后相關(guān) (P<0.05),患者的年齡、性別、有無腫瘤家族史、Edmondson分級、ALT、HBsAg、有無肝硬化等與患者預(yù)后無顯著相性。多因素分析結(jié)果表明，多發(fā)子灶是肝細胞癌患者預(yù)后的獨立影響因(P=0.043)，而AVIL表達水平、BCLC分期、腫瘤大小、有無癌栓、AFP、AST、γ-GT、有無肝外轉(zhuǎn)移并不是影響預(yù)后的獨立因素，如表3所示。

圖2 AVIL基因不同表達水平對肝癌患者生存時間的影響

3 討論

AVIL定位于染色體區(qū)域12q14，蛋白分子質(zhì)量為92 kD[10]。其編碼的蛋白最初是通過篩選小鼠腦cDNA文庫中鑒定發(fā)現(xiàn)的凝溶膠蛋白家族新成員，因其氨基酸序列與同屬于凝溶膠蛋白家族的Adseverin和絨毛蛋白(Villin)分別有65%和75%的高度同源性而被命名為Advillin[11]。凝溶膠蛋白是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，具有對肌動蛋白捆綁、結(jié)合和維持性質(zhì)的功能，在細胞運動中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等過程[12]。Advillin與凝溶膠蛋白家族成員共享6個凝溶膠蛋白同源(GH)結(jié)構(gòu)域，以及含有與Villin相似的羧基末端頭部結(jié)構(gòu)(cHP)[9]。cHP是決定肌動蛋白捆綁能力的重要區(qū)域，具有與F-肌動蛋白結(jié)合的功能[13]。

表3 肝癌患者的Cox單因素及多因素分析

注：多變量模型中僅納入單變量模型有統(tǒng)計學(xué)意義的變量；▽表示該值P<0.05, ▲▲表示該值P<0.01。

AVILmRNA主要在成人胃腸道、骨骼肌中表達，在其他組織表達水平非常低[14]，其中在胎兒腸中最低。AVIL具有調(diào)控細胞運動的能力，其可以通過產(chǎn)生片狀偽足和局灶性粘連，影響調(diào)控足細胞遷移率(PMR)[15]，一旦AVIL發(fā)生隱性突變會降低體外蛋白質(zhì)的肌動蛋白成束能力，使足細胞功能的喪失誘導(dǎo)腎病綜合癥的發(fā)生[8]。研究發(fā)現(xiàn)，AVIL是一種促進纖毛生成的調(diào)節(jié)劑，它能切斷肌動蛋白絲來調(diào)節(jié)細胞骨架肌動蛋白組織進而控制纖毛的長度[16]。多年來，人們對AVIL編碼的Advillin蛋白了解主要圍繞其是一種感覺神經(jīng)元特異性肌動蛋白結(jié)合蛋白。許多研究反復(fù)證實， Advillin與神經(jīng)突生長和形態(tài)發(fā)生以及軸突再生密切相關(guān)[17-18]，其豐富表達于背根神經(jīng)節(jié)之中[19]。Chuang等[20]在患有疼痛性周圍神經(jīng)病的小鼠的腦脊液中檢測到由Advillin蛋白，并認為其是診斷周圍神經(jīng)病變的生物特征。同家族成員Villin，已被證實與多種消化道腫瘤具有明確的相關(guān)性[21]。李峰等[22]研究發(fā)現(xiàn)Villin在肝細胞癌中的表達明顯高于正常肝組織，認為其可能作為一種癌基因參與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展。然而，AVIL(Advillin)在腫瘤中的相關(guān)研究仍較空白。為了更多了解凝溶膠蛋白超家族蛋白在腫瘤的表達及功能，將AVIL作為腫瘤標志物或治療靶點的潛力。基于AVIL與Villin具有極其相似的結(jié)構(gòu)和功能，推測其可能是一個新的腫瘤標志物。

通過免疫組化法分析可知，AVIL主要在癌組織中高表達陽性率達64.5%，表明AVIL(Advillin)作為凝溶膠蛋白家族中的成員之一，可能與同家族成員Villin相似，在肝癌發(fā)生過程中能發(fā)揮促癌的作用[23]。肝癌的分期對判斷患者預(yù)后十分重要。晚期原發(fā)性肝癌總體預(yù)后差，多數(shù)據(jù)統(tǒng)計報道中位生存期均小于1年[24]。目前，對原發(fā)性肝癌晚期范圍界定一直比較模糊。BCLC分期中將處于BCLC-C期的患者定義為晚期，肝癌晚期的患者存在多發(fā)子灶或遠處轉(zhuǎn)移，治療難度大，預(yù)后較差。結(jié)果表明，AVIL高表達的患者，臨床分期更差、病理分級更高(P=0.032、P=0.033)，其表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。因此，AVIL表達水平可能用于肝細胞癌惡性程度及患者預(yù)后趨勢的評估。

通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，AVIL低表達患者的術(shù)后生存時間明顯高于高表達患者。Cox單因素表明，AVIL表達水平、BCLC分期、腫瘤大小、有無癌栓、有無多灶性、AFP、AST、γ-GT、有無肝外轉(zhuǎn)移都是影響患者生存時間的相關(guān)因素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將上述9個具有統(tǒng)計學(xué)意義的單因素代入Cox多因素分析，結(jié)果表明，多發(fā)子灶可作為預(yù)測肝細胞癌患者預(yù)后不佳的一個獨立因素(P=0.043)，此外，其余8個因素與預(yù)后有相關(guān)性，但不能作為影響肝癌患者預(yù)后的獨立因素。

綜上所述，AVIL可能是一個新的癌癥相關(guān)基因，它與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展以及與肝癌患者的生存預(yù)后有密切聯(lián)系。AVIL高表達提示腫瘤惡性程度高、預(yù)后不佳，可能作為肝細胞癌患者有意義的生存期預(yù)測因子，但不作為一個判斷預(yù)后的獨立因素，同時發(fā)現(xiàn)腫瘤多發(fā)子灶可作為判斷預(yù)后的獨立危險因素。由于目前只驗證了部分臨床標本，其在腫瘤中的機制及功能還不明確。肝癌的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的活動密切相關(guān)，表明存在大量調(diào)節(jié)細胞調(diào)節(jié)因子，不能排除其他凝溶膠蛋白家族成員在過程中的影響。AVIL基因是否能作為一個有效的腫瘤標志物，還有待進一步研究和探索。

4 結(jié)論

(1)AVIL高表達提示肝癌患者惡性程度高、預(yù)后不佳，其表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

(2)AVIL是肝癌患者有意義的生存期預(yù)測因子，但不作為一個判斷預(yù)后的獨立因素。