李佳懌 陶然 陳美琪 王婭玲 王集會

摘 ?????要：研究了美洲大蠊酶解液凍干粉（LPEHPA）多糖含量及對多種腫瘤細胞株增殖的抑制作用、對非洲綠猴腎細胞株的抗氧化作用以及對脂多糖（LPS）誘導的小鼠巨噬細胞的抗炎作用。采用水提酶解法提取美洲大蠊的有效成分，通過苯酚硫酸法測定多糖含量，MTT法測定其對Bel-7402、A549、M231及MCF-7 四種不同的腫瘤細胞株的抑制率;建立過氧化氫誘導的氧化損傷模型，MTT法觀察藥物介入后的細胞存活率;酶聯(lián)免疫法檢測細胞上清液中炎癥因子TNF-α和IL-6的濃度。結果LPEHPA中多糖含量為4.72%;對四種腫瘤細胞最高抑制率分別為65.02%、76.05%、62.92%和65.10%;LPEHPA對非洲綠猴腎細胞株（Vero）有明顯保護作用，濃度為1 mg·mL^-1時，與對照組相比細胞存活率提升了37.52%;脂多糖誘導炎癥后，與模型組相比，加藥組TNF-α、IL-6濃度顯著減少，與空白組相比具有顯著性差異。通過對LPEHPA藥理活性結果分析，LPEHPA在機體可承受毒性范圍內(nèi)，具有良好的抗腫瘤、抗氧化及抗炎活性。

關 ?鍵 ?詞：美洲大蠊;抗腫瘤;抗氧化;抗炎

中圖分類號：TQ 016 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號：?1671-0460（2020）03-0575-05

Determination of Polysaccharide Content and Pharmacological Activity of Lyophilized Powder Extracted From Periplaneta Americana

???LI Jia-yi¹，?TAO Ran¹，?CHEN Mei-qi²，?WANG Ya-ling¹，?WANG Ji-hui^3*

（1. School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355，?China;

2. School of Traditional Chinese Medicine， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355，?China;

3. Experimental Center， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355，?China）

Abstract： ?To study the content of polysaccharides in the lyophilized powder of enzymatic hydrolysate of Periplaneta americana （LPEHPA） and the inhibitory effect of Periplaneta americana on the proliferation of various cancer cells， the antioxidant effect of Vero cell lines and the anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide （LPS）-induced mouse macrophages，the effective components of Periplaneta americana were extracted by water extraction and enzymatic hydrolysis， and the content of polysaccharides was determined by phenol sulfuric acid method. The inhibition rates?of Periplaneta americana against four different tumor cell lines Bel-7402， A549， M231 and MCF-7 were?determined by MTT method. The oxidative damage model induced by hydrogen peroxide was established， and the cell survival rate after drug intervention was observed by MTT method. The concentration of TNF-α and IL-6 in cell supernatant was measured by enzyme-linked immunoassay. The results?showed that， the content of polysaccharides in LPEHPA was 4.72%. The highest inhibition rates of the four tumor cells were 65.02%， 76.05%， 62.92% and 65.10%， respectively. LPEHPA had significant protective effects on African green monkey kidney cells （Vero）， and cell viability increased by 37.52% compared with the control group with the concentration of 1 mg·mL^-1. After induction of inflammation with LPS， the concentration of TNF-α and IL-6 in the medicated group was significantly reduced compared with the model group， and there was?a significant difference compared with the blank group.The analysis results of the pharmacological activity?has proved that?LPEHPA has good anti-tumor， anti-oxidation and anti-inflammatory activities in the range of?sustainable toxicity.

Key words： ?Periplaneta americana; ?anti-tumor; ?antioxidant; ?anti-inflammatory

美洲大蠊 Periplaneta americana （L.）為昆蟲綱，蜚蠊目，蜚蠊科，俗稱“蟑螂”。在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《新修本草》等古籍中均有記載，具有利水消腫、活血散瘀、解毒消疳等多種功效，多項文獻記載美洲大蠊具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、增強免疫等多種治療作用^[1]。本實驗在前期美洲大蠊水提液總蛋白及總糖胺聚糖工藝優(yōu)化條件的前提下，重點研究了LPEHPA中多糖的含量以及其對多種腫瘤細胞株的體外增殖抑制效果、對非洲綠猴腎Vero細胞株的抗氧化活性以及對RAW264.7細胞株的抗炎作用等，為進一步研究美洲大蠊藥效成分及體內(nèi)外藥理活性提供基礎。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

PHS-25 型 pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）;KQ-500E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;FA1004N 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;ST-16R高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;遠紅外輻射干燥箱（海陽光實驗儀器有限公司）;EL340i型全自動酶標儀（Molecular Davices）;TS100型倒置顯微鏡（日本尼康）;UV9100B型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）。

1.2 ?試劑與材料

胰蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）;DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）;PBS磷酸鹽緩沖溶液（美國Hyclone公司）;FBS胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;胰酶細胞消化液（美國Hyclone公司）;雙抗（美國Hyclone公司）;小鼠TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）;所用試劑均為分析純。肝癌Bel-7402細胞株、乳腺癌M231細胞株、乳腺癌MCF-7細胞株、肺腺癌A549細胞株、非洲綠猴腎Vero細胞株均由山東省立醫(yī)院提供。

1.3 ?材料

美洲大蠊，購于河北安國中藥材市場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學高德民副教授鑒定為蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬美洲大蠊Periplaneta americana（L.）。

2 ?實驗方法

2.1 ?LPEHPA制備方法

將美洲大蠊清洗、勻漿、冷凍干燥、粉碎、過40目篩備用。精密稱取美洲大蠊凍干粉3份，每份1.000 g，分別加入到100 mL具塞錐形瓶，以固定溫度50 ℃ 超聲20 min，向超聲后美洲大蠊提取液中加入胰蛋白酶2 ?000 U，在37 ℃，pH=8的條件下，酶解3 h，每小時調(diào)一次pH值。酶解液40 ℃條件下超聲70 min充分提取有效成分，提取液在

3 000 r·min^-1離心10 min，取上清液抽濾，并定容到100 mL 容量瓶中，冷凍干燥^[2]，得LPEHPA。

2.2 ?總多糖的測定

2.2.1 ?標準曲線的繪制

精確稱取無水葡萄糖1.250 g，至250 mL容量瓶中加蒸餾水定容，取1 mL于50 mL容量瓶，定容。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至試管，并分別加入蒸餾水補足1 mL，分別加入6%苯酚1、5 mL濃硫酸震蕩，反應15 min，于490 nm處測定吸光值，得標準曲線回歸方程為Y=0.961X+0.019?8（ R²=0.998 1），表明葡萄糖標準溶液在吸光度線性范圍內(nèi)線性關系良好^[3，4]。

2.2.2 ?提取率計算

取上述LPEHPA0.5 g，精密稱定，定容至100 mL容量瓶中，再從中取1 mL定容至10 mL容量瓶中，并按照上述方法測定吸光度，計算總多糖含量，總多糖的提取率為：

總多糖提取率（%）=Y?/?m

式中：m?—稱取凍干粉質量，?g;

Y?—總多糖的量。

2.3 ?細胞培養(yǎng)

在37 ℃ 水浴條件下將凍存細胞融化。消毒處理后，取出細胞轉移至離心管中，然后以1 000 r/min轉速離心3 min。離心結束后棄去上清凍存液，并向各離心管中加入含有10 % 胎牛血清的1640培養(yǎng)基1 mL，混勻成細胞懸液，轉移至培養(yǎng)瓶后加入3～4 mL 1640培養(yǎng)基，結束后將其置于條件為37 ℃、含有5 % CO₂及適度濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)^[5，6]。

待細胞成長至80% ～90% 時對培養(yǎng)中5種不同細胞株進行細胞傳代，使用PBS緩沖溶液反復清洗3～4次后加入胰蛋白酶溶液進行消化，待培養(yǎng)瓶中細胞消化至細胞蜷縮不再貼付瓶壁時加入RPMI-1640培養(yǎng)基并反復吹打至其成單細胞懸液，再分裝至培養(yǎng)瓶中。放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 ?LPEHPA溶液配制

精密稱取LPEHPA10.00 mg，溶于5 mL 不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中配成含水提液凍干粉2 mg·mL^-1的初始濃度，消毒后帶入超凈臺中，于超凈臺中透過0.22 μm的濾膜進行過濾，然后依次加入不同量1640培養(yǎng)基進行稀釋，配成2、1.8、1.6、1.4、1.2、1、0.5 mg·mL^-1的藥物濃度。

2.5 ?體外抗腫瘤實驗方法

將處于對數(shù)生長期的4種不同腫瘤細胞株消化后加入含有10 % 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基并稀釋成濃度為1×106個·mL^-1的細胞懸液，經(jīng)過反復輕輕吹打混勻后將其接種于96孔板中，每孔中加入100 μL，接入后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80 %～90 % 后，棄去培養(yǎng)基并按上述藥物配置方式將不同濃度LPEHPA稀釋液注于各孔，每孔加入藥物100 μL，每個藥物濃度設置5個復孔，設置僅加入不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為體外抗腫瘤實驗的空白組。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于各孔中加入5 mg·mL-1 MTT溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱中避光反應4 h。最后棄去上清液，各孔均加入100 μL DMSO，在酶標儀490 nm波長條件下測定各孔OD值，按下述數(shù)據(jù)處理方式計算藥物對細胞的抑制率，通過對比LPEHPA對不同腫瘤細胞抑制效果對LPEHPA進行抗腫瘤實驗測試。

2.6 ?體外抗氧化實驗

2.6.1 ?細胞鋪板

將處于對數(shù)生長期的非洲綠猴腎Vero細胞株經(jīng)過胰蛋白酶消化后稀釋成密度約4.5×10⁴/（個·mL^-1）的細胞懸液，然后通過反復吹打混勻后導入96孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。

2.6.2 ?加藥

設置細胞空白對照，模型組只加過氧化氫，給藥組加藥干預后加入過氧化氫。

2.6.3 ?過氧化氫的配置

取33 mL過氧化氫加入到5 mL PBS緩沖溶液中，配至濃度6 400 μmol·L^-1，再通過培養(yǎng)基稀釋10倍，通過二倍化稀釋作為造模條件進行最大濃度摸索。

2.6.4 ?造模

加藥24 h后，將藥液吸出，用PBS沖洗兩次，每孔加入100 μL過氧化氫，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，正式實驗前，篩選最佳造模條件。篩選時，加藥過程使用培養(yǎng)基代替，24 h后，去掉培養(yǎng)基，每孔加入不同濃度過氧化氫，通常采用80 μmol·L^-1為實驗濃度，4 h造模。

2.6.5 ?加入MTT

造模結束后，加入20 μL的5 mg·mL^-1的MTT，靜置4 h 后，吸出MTT，加入DMSO并于490 nm波長下進行檢測^[7，8]。

2.7 ?體外抗炎實驗

2.7.1 ?細胞培養(yǎng)

將凍存的RAW264.7細胞復蘇， 用DMEM高糖培養(yǎng)基 （含10 %胎牛血清、1 %雙抗） ， 在37 ℃、5%?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 細胞10～15×10⁴（個·mL^-1）， 鋪于24孔板中，每孔1 mL，藥物每個濃度設置3個復孔，ELISA法檢測其中TNF-α、IL-6的含量^[9]。

2.7.2 ?加藥及脂多糖誘導炎癥

鋪板后24 h后，吸出培養(yǎng)液，加入2 μg·mL^-1脂多糖500 μL，并加入對應藥物500 μL，其中藥物配制濃度及脂多糖濃度始終為方案濃度兩倍，加藥時兩者相互稀釋。

2.7.3 ?TNF-α、IL-6含量測定

酶聯(lián)免疫法測定上清液中TNF-α、IL-6的濃度，取上述上清液按ELISA試劑盒說明書進行操作，450 nm測其吸光度，并取標準液進行標準曲線的繪制。

2.8 ?數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用spss17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 ?數(shù)據(jù)處理

4 ?結果與分析

4.1 ?LPEHPA總多糖測定

根據(jù)2.2方法測定，LPEHPA總多糖含量為4.72 %。

4.2 ?LPEHPA體外抗腫瘤測試

4.2.1 ?LPEHPA體外抗肝癌Bel-7402細胞株結果

由圖1可知，隨給藥濃度的增加，當LPEHPA濃度低于1 mg·mL^-1時，其水提物對肝癌Bel-7402細胞株并無增殖抑制效果。當LPEHPA應用濃度高于1 mg·mL^-1時，與空白組相比產(chǎn)生增殖抑制效果（P<0.01），最高增殖抑制率于1.6 mg·mL^-1時達到65.02 %。

4.2.2 ?LPEHPA體外抗肺腺癌A549細胞株結果

由圖2可知，隨給藥濃度的增加，LPEHPA于0.5～2 mg·mL^-1實驗濃度范圍內(nèi)與空白組相比對肺腺癌A549細胞株均具有一定增殖抑制效果（P<0.01），其使用濃度于1 mg·mL^-1濃度以下增值效果較弱，當水提物使用濃度高于1 mg·mL^-1時，LPEHPA對肺腺癌A549細胞株的增殖抑制效果明顯提升，于1 mg·mL^-1濃度下抑制率達到最高，為76.05 %。

4.2.3??LPEHPA體外抗乳腺癌M231細胞株實驗結果

由圖3可知，隨給藥濃度的增加，于0.5～1.8 mg·mL^-1實驗濃度范圍內(nèi)，LPEHPA對乳腺癌M231細胞株與空白組相比均具有增殖抑制效果（P<0.01），總體抑制率在實驗濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，于1.4 mg·mL^-1時LPEHPA對乳腺癌M231細胞株的增殖抑制率達到最高，增殖抑制率為62.92 %。

4.2.4 ?LPEHPA體外抗乳腺癌MCF-7細胞株結果

由圖4可知，隨給藥濃度的增加，在0.5～2 mg·mL^-1?實驗濃度范圍內(nèi)，LPEHPA對乳腺癌MCF-7細胞株與空白組相比均具有一定的增殖抑制效果（P<0.01），與乳腺癌M231增殖抑制趨勢幾乎一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，于1.2 mg·mL^-1時體外增殖抑制率達到最高，為65.10 %。

4.3 ?LPEHPA體外抗氧化實驗結果

由圖5可知，隨給藥濃度的增加，在0.062 5～1 mg·mL^-1濃度范圍內(nèi)，LPEHPA呈現(xiàn)出優(yōu)良的抗氧化活性，整體呈線性趨勢，具有量效依賴關系。與H₂O₂對照組相比Vero細胞經(jīng)過0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg·mL^-1LPEHPA處理后，細胞存活率分別提升至50.72%、54.73%、58.63%、63.76%及82.68%（P<0.01）。同時，通過細胞毒實驗篩選，在實驗濃度范圍內(nèi)，LPEHPA對Vero細胞無毒。

4.4 ?LPEHPA體外抗炎實驗結果

由圖6可知，隨給藥濃度的增加，在0.125～2 mg·mL^-1濃度范圍內(nèi)，LPEHPA分泌IL-6明顯少于LPS組。由圖7可知，隨給藥濃度的增加，在0.125～2 mg·mL^-1濃度范圍內(nèi)，LPEHPA呈現(xiàn)出優(yōu)良的抗炎能力，整體呈線性趨勢，具有量效依賴關系。與空白對照組相比細胞經(jīng)過各濃度藥物處理后，腫瘤壞死因子分泌量下降（P<0.05），同時，通過細胞毒實驗篩選，在藥物濃度小于2 mg·mL^-1，LPEHPA對RAW264.7細胞無毒。

5 ?討?論

本實驗是在前期篩選出美洲大蠊最佳水提取總蛋白及總糖胺聚糖工藝的前提下，探究LPEHPA對4種不同腫瘤細胞的體外抗腫瘤細胞株活性及其作用于非洲綠猴腎Vero細胞株的體外抗氧化活性。實驗數(shù)據(jù)表明LPEHPA對4種不同腫瘤細胞均具有優(yōu)良的抗腫瘤活性，僅從最高腫瘤增殖抑制效果進行比較，筆者認為LPEHPA對肺腺癌A549細胞株的增殖抑制效果最佳，其次為乳腺癌MCF-7細胞株，再次為肝癌Bel-7402細胞株，最后為乳腺癌M231細胞株。其中，藥物對肺腺癌A549細胞株的體外抗腫瘤療效最顯著，最高抑制率可達到76.05%;藥物對兩種不同乳腺癌細胞在實驗濃度范圍內(nèi)增殖抑制效果幾乎一致，最高增殖抑制效果接近，此實驗結果為后期進一步研究美洲大蠊抗腫瘤活性提供了基礎;實驗結果顯示，LPEHPA在較低濃度時對肝癌Bel-7402細胞株無效，而當其使用濃度高于1 mg·mL^-1?時具有增殖抑制效果。實驗通過對Vero細胞進行體外抗氧化活性研究，顯示LPEHPA具有優(yōu)良的抗氧化活性，與總多糖的濃度呈正相關關系，提示多糖可能為其主要的抗氧化成分。腫瘤壞死因子 TNF-α和IL-6均由活化的巨噬細胞產(chǎn)生， 兩者均可引發(fā)機體炎癥、發(fā)熱、關節(jié)炎等多種疾病，實驗結果證明LPEHPA可降低TNF-α、IL-6含量，這為今后進一步研究美洲大蠊的抗炎作用提供了依據(jù)。

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